王良宏，楊 麗，潘 衛(wèi)，李 興，楊國珍△

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴州貴陽550009；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院生殖中心，四川成都610041）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）嚴(yán)重危害人類健康，目前臨床常用的抗病毒藥物對慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的治療效果并不十分理想，藥物不能有效地阻止HBV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和再感染。HBV感染早期，病毒與細(xì)胞相互作用的機(jī)制并不清楚，這可能會影響到藥物的設(shè)計(jì)與治療方案的更新。HBV通過外膜蛋白與肝細(xì)胞膜上的特異受體相互識別，黏附于細(xì)胞膜上［1］，這種特異性的識別和黏附是HBV感染嗜性（組織和宿主特異性）的原因之一。大量研究顯示，HBV的preS1肽段不僅直接參與了病毒與細(xì)胞的結(jié)合，而且其作用是十分關(guān)鍵和必需的［2－3］。肝細(xì)胞受體識別位點(diǎn)在preS1的21～47表位［4－7］。本課題以人肝癌細(xì)胞（HepG2）為實(shí)驗(yàn)對象，采用免疫磁珠法分離與preS1肽段結(jié)合的受體蛋白［8］，以期發(fā)現(xiàn)與HBV感染相關(guān)的受體蛋白，從而為HBV感染早期與細(xì)胞相互作用機(jī)制的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞株：HepG2細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。試劑：生物素標(biāo)記preS1肽段購自賽百盛生物公司，鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠購自柏匯申生物科技有限公司，細(xì)胞核－細(xì)胞質(zhì)－細(xì)胞膜制備試劑盒購自普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、雙抗（青霉素100U／mL，鏈霉素100mg／mL）的DEME高糖培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞膜蛋白的提取 收集大約2×107個(gè)細(xì)胞，嚴(yán)格按照細(xì)胞核－細(xì)胞質(zhì)－細(xì)胞膜制備試劑盒的說明書進(jìn)行提取。

1.2.3 免疫磁珠法分離與preS1結(jié)合的蛋白 取2mg膜蛋白同300μL生物素標(biāo)記的preS1，加PBS至1mL，4℃孵育過夜。次日取出后加入濃度為0.15g／L的鏈霉親和素標(biāo)記磁珠300μL，補(bǔ)足PBS至1 200μL，37℃搖床孵育30min。將Epp管插入磁力架，吸出未結(jié)合的部分，然后用PBS將磁珠洗滌3次，棄PBS，加入裂解液30μL冰浴30min，將與preS1結(jié)合的蛋白裂解出來。

1.2.4 十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白 將裂解的蛋白液用5%的濃縮膠，12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分離，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，UMAX掃描儀進(jìn)行掃描。

1.2.5 質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索 選取在凝膠中顏色較深且重復(fù)性好的6條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。LC-MS／MS質(zhì)譜分析及檢索由中國科學(xué)院動物研究所生物膜與膜生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

2 結(jié) 果

2.1 HepG2細(xì)胞膜蛋白與preS1結(jié)合蛋白的分離結(jié)果2mg HepG2膜蛋白與300μg的preS1結(jié)合，經(jīng)300μL鏈霉親和素標(biāo)記磁珠獲得的結(jié)合蛋白，通過SDS-PAGE分離出了16條帶（圖1），（45～97）×103的有9條帶，＞97×103的有5條帶，＜20×103的有2條帶。

2.2 HepG2細(xì)胞膜蛋白與preS1結(jié)合蛋白的質(zhì)譜分析 選取其中顏色較深且重復(fù)性好的6條帶（圖1）進(jìn)行了質(zhì)譜分析，成功分析出14個(gè)蛋白，除Act1p屬酵母菌科外，其余均為人的種屬。剩余的13個(gè)蛋白包含肌動蛋白β（actin，beta）、微管蛋白β（Tubulin，beta）、ATP合酶（ATP synthase）、微管蛋白α－1A鏈（Tubulin alpha-1Achain）、熱休克蛋白60（60kDa heat shock protein，HSP60）、角蛋白1（keratin 1）、keratin 10、表皮細(xì)胞角蛋白2（epidermal cytokeratin 2）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白前體78（78kDa glucose-regulated protein precursor，GRP78）、熱休克蛋白70（Heat shock 70kDa protein 9，Mortalin）以及3個(gè)未命名的蛋白。質(zhì)譜鑒定獨(dú)立肽段數(shù)大于或等于2，評分小于或等于1E-5為結(jié)果可靠，各蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果，見表1。

圖1 SDS-PAGE分離HepG2膜蛋白與preS1結(jié)合蛋白

表1 HepG2與preS1結(jié)合蛋白的質(zhì)譜結(jié)果

3 討 論

HBV嚴(yán)重危害人類健康，目前臨床常用的抗病毒藥物對CHB的治療效果并不十分理想，藥物不能有效地阻止HBV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和再感染。HBV感染早期，病毒與細(xì)胞相互作用機(jī)制的研究顯得尤為重要。

本課題采用了免疫磁珠分離法，該方法是一種省時(shí)、省力、方便快捷的方法，可有效分離受體蛋白［8］。本研究成功分離鑒定出14種與preS1肽段結(jié)合的蛋白，主要包括以下幾類。（1）微管蛋白：微管蛋白β，微管蛋白α-1A鏈。微管是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分，它由微管蛋白β和微管蛋白α兩個(gè)亞基結(jié)合在一起。維持細(xì)胞的形態(tài)，可影響膜內(nèi)細(xì)胞器的空間定位和分布，參與物質(zhì)運(yùn)輸及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。（2）線粒體相關(guān)蛋白：ATP合酶。線粒體上的ATP合酶是一個(gè)與ATP合成和水解相關(guān)的雙向酶復(fù)合物。ATP合酶主要存在于線粒體內(nèi)膜，但已有研究表明在細(xì)胞表面也存在ATP合酶［9］，并且最近的研究表明ATP合酶可作為受體參與脂類代謝調(diào)控和腫瘤免疫標(biāo)志識別等［10］。（3）HSP：HSP60、Mortalin、GRP78。HSP是一類所有細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下，由熱休克基因編碼合成的序列高度保守的蛋白，且能夠?qū)垢鼮閲?yán)重的應(yīng)激損傷，這種現(xiàn)象稱為熱休克反應(yīng)。HSP 60作為線粒體蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)［11］，涉及線粒體蛋白和大分子的組裝，有利于輸入蛋白的正確折疊，在線粒體基質(zhì)中正確的產(chǎn)生多肽。王芳等［12］在文中指出，HBV感染的肝細(xì)胞會釋放大量的可溶性HSP60分子，其表達(dá)水平與HBV-DNA水平呈正相關(guān)。Mortalin和GRP78均屬于HSP70家族。Mortalin主要定位于線粒體，參與天然免疫和獲得性免疫，有研究指出Mortalin是一種功能性膜蛋白，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中扮演著重要角色。

GRP78主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，但在細(xì)胞膜上也有表達(dá)，細(xì)胞膜上的GRP78參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗原提呈及病毒入侵等。有研究證實(shí)GRP78是2型登革熱病毒（dengue virus serotype 2）受體復(fù)合物的主要成分之一［13］。楊鳳等［14］通過激光共聚焦顯微鏡觀察到GRP78在細(xì)胞膜上均勻分布，并指出GRP78可能通過與preS1結(jié)合參與HBV早期感染過程，葛以躍等［15］聯(lián)合利用GST Pull-Down與現(xiàn)代蛋白組學(xué)技術(shù)鑒定了2種與preS1特異結(jié)合蛋白：GRP78和GRP75。以上的研究提示，GRP78在HBV感染初期黏附有著非常重要的作用，其在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗原提呈等過程中發(fā)揮重要作用。GRP78能與preS1特異結(jié)合并且在肝細(xì)胞膜上表達(dá)，可能參與HBV早期侵入肝細(xì)胞的過程，本研究擬將GRP78作為preS1的候選受體，下一步將對其在HBV早期感染中的作用機(jī)制進(jìn)行研究，為抗病毒藥物的設(shè)計(jì)與治療方案的更新打下基礎(chǔ)。

［1］ De Meyer S，Gong ZJ，Suwandhi W，et al.Organ and species specificity of hepatitis B virus（HBV）infection：a review of literature with a special reference to preferential attachment of HBV to human hepatocytes［J］.J Viral Hepat，1997，4（3）：145-153.

［2］ Paran N，Geiger B，Shaul Y.HBV infection of cell culture：evidence for multivalent and cooperative attachment［J］.EMBO J，2001，20（16）：4443-4453.

［3］ Lu X，Block T.Study of the early steps of the Hepatitis B Virus life cycle［J］.Int J Med Sci，2004，1（1）：21-33.

［4］ Yokosuka Q，Arai M.Molecular biology of hepatitis B virus：effect of nucleotide substitutions on the clinical features of chronic hepatitis B［J］.Med Mol Morphol，2006，39（3）：113-120.

［5］ Bruss V.Hepaitits B virus morphogenesis［J］.World J Gastroenterol，2007，13（1）：65-73.

［6］Schaefer S.Hepatitis B viru taxonomy and hepatitis B virus genotypes［J］.World J Gastroenterol，2007，13（1）：14-21.

［7］ Abou-Jaoude G，Mol ina S，Maurel P，et al.Myristoylation signal transfer from the large to the middle or the small HBV envelope protein leads to a loss of HDV particles infectivity［J］.Virology，2007，365（1）：204-209.

［8］ 楊麗，王良宏，潘衛(wèi)，等.免疫磁珠法分離preS1結(jié)合蛋白［J］.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，38（1）：24-26.

［9］ Burrell HE，Wolodarski B，F(xiàn)oster BJ，et al.Human keratinocytes release ATP and utilize three mechanisms for nucleotide interconversion at the cell surface［J］.J Bio Chen，2005，280（33）：29667-29676.

［10］杜艷，高鋒.細(xì)胞表面ATP合酶的研究進(jìn)展［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2009，29（6）：741-743.

［11］Martin JE，Swash M，Mather K，et al.Expression of the human groEL stress-protein homologue in the brain and spinalcord［J］.J Neurol Sci，1993，118（2）：202-206.

［12］王芳，史麗云.熱休克蛋白60介導(dǎo)的TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模式和“危險(xiǎn)信號”學(xué)說［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（8）：1134-1137.

［13］Jindadamrongwech S，Thepparit C，Smith DR.Identification of GRP78（Bip）as a liver cell expressed receptor element for dengue virus serotype 2［J］.Arch Virol，2004，149（5）：915-927.

［14］楊鳳，丁崗強(qiáng)，唐霓，等.GRP78在HePG2細(xì)胞的亞細(xì)胞定位及真核表達(dá)［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2009，34（11）：1328-1330.

［15］葛以躍，崔侖標(biāo)，史智揚(yáng)，等.應(yīng)用蛋白組學(xué)方法篩選和鑒定乙型肝炎病毒PreS1結(jié)合蛋白［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25（5）：459-464.