周 潔，李玉銀，趙昌彩，刁愛坡

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

泛素連接酶Nedd4調(diào)控人前列腺癌細(xì)胞的增殖與凋亡

周 潔，李玉銀，趙昌彩，刁愛坡

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

為了研究泛素連接酶Nedd4對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，利用小RNA干擾技術(shù)，通過慢病毒包裝，侵染前列腺癌細(xì)胞DU145，達(dá)到下調(diào)Nedd4表達(dá)的目的．MTT檢測(cè)表明，下調(diào)Nedd4表達(dá)可以抑制DU145細(xì)胞的增殖；DAPI染色發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Nedd4表達(dá)的DU145細(xì)胞對(duì)星形孢菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更加敏感．這些結(jié)果都說明，下調(diào)Nedd4的表達(dá)不僅可以抑制DU145腫瘤細(xì)胞增殖，而且可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡．

Nedd4；前列腺癌細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

泛素連接酶和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]．在哺乳動(dòng)物中，被鑒定的泛素連接酶有600多種．泛素連接酶主要分兩大類：RING家族和HECT家族．HECT家族由28種蛋白組成，基于結(jié)構(gòu)的不同，HECT泛素連接酶家族成員多數(shù)分屬于兩個(gè)亞家族：Nedd4家族和HERC家族[2]．

Nedd4家族包括9個(gè)成員：Nedd4-1、Nedd4-2 (Nedd4L)、ITCH、Smurf1、Smurf2、WWP1、WWP2、NEDL1、NEDL2．這9個(gè)成員具有相似的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)包括一個(gè)N端的C2結(jié)構(gòu)域，中間有2～4個(gè)WW結(jié)構(gòu)域，C端的與E6AP(E6 associated protein)[3]同源的COOH端[4]．Nedd4家族泛素連接酶在癌癥發(fā)生過程中起著重要作用．

在研究基因功能方面，RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)得到廣泛應(yīng)用．RNAi是一種普遍的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，由Fire等[5]于1998年發(fā)現(xiàn)．目前，主要通過兩條途徑來實(shí)現(xiàn)RNAi：第一，通過轉(zhuǎn)染短鏈干擾RNA(short interfering RNAs，siRNA)，實(shí)現(xiàn)目的基因沉默；第二，利用表達(dá)載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行短鏈發(fā)夾RNA(short hairpin RNAs，shRNA)的轉(zhuǎn)錄，完成目的基因表達(dá)的降低[6-8]．

無論是轉(zhuǎn)染siRNA還是shRNA的轉(zhuǎn)錄，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和活體實(shí)驗(yàn)中[9]，RNAi的作用都可能出現(xiàn)被抑制的現(xiàn)象．Rubinson等[10]利用shRNA慢病毒系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、干細(xì)胞、受精卵及已分化的后代細(xì)胞中干擾目的基因表達(dá)．shRNA慢病毒系統(tǒng)進(jìn)行的基因沉默具有高特異性、高穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)，并且能夠在多種細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因小鼠中實(shí)現(xiàn)基因沉默．慢

病毒載體能夠快速有效地實(shí)現(xiàn)基因沉默，這為基因治療提供了一種新方法．

李季林等[11]通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染shRNA干擾Nedd4-1表達(dá)，證明Nedd4-1促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖并且影響細(xì)胞凋亡．本研究利用慢病毒載體，穩(wěn)定下調(diào)人前列腺癌細(xì)胞DU145中Nedd4的表達(dá)，構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系，探討Nedd4對(duì)人前列腺癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，試圖揭示Nedd4在前列腺癌中的功能，探索治療前列腺癌的新靶點(diǎn)．

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人前列腺癌細(xì)胞DU145、人胚腎上皮細(xì)胞系HEK293T，本實(shí)驗(yàn)室保藏．Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，Invitrogen公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Penicilin and Streptomycin、L-Glutamic，Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、DMSO，Solarbio公司；Nedd4抗體、β-actin單克隆抗體、干擾質(zhì)粒載體pLKO.1-Nedd4 shRNA及陰性對(duì)照載體pLKO.1-scramble、MISSON Lentiviral Packaging Mix慢病毒包裝試劑盒，Sigma公司．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 shRNA干擾載體慢病毒包裝及檢測(cè)

根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)原則，在Sigma公司共購(gòu)得5個(gè)Nedd4 shRNA目的序列，分別為：

①TRCN0000272424：CCGGCGGTTGGAGAATG TAGCAATACTCGAGTATTGCTACATTCTCCAA CCGTTTTTC；②TRCN0000272425：CCGGAGTGC TACTCGCAGCTATTTACTCGAGTAAATAGCTGCG AGTAGCACTTTTTTC；③TRCN0000272476：CCGG GCTGAACTATACGGTTCAAATCTCGAGATTTGAA CCGTATAGTTCAGCTTTTTC；④TRCN000027 2477：CCGGTACGTGAGAGTGACGTTATATCTCGA GATATAACGTCACTCTCACGTATTTTTC；⑤TRCN 0000284755：CCGGCCGGAGAATTATGGGTGTCAA CTCGAGTTGACACCCATAATTCTCCGGTTTTTC．

利用HEK293T細(xì)胞，參照Sigma公司MISSON Lentiviral Packaging Mix說明書進(jìn)行慢病毒包裝，同時(shí)包裝陰性對(duì)照組scramble．收集慢病毒，侵染DU145細(xì)胞，Western blot檢測(cè)Nedd4蛋白表達(dá)情況．1.2.2 下調(diào)Nedd4表達(dá)的DU145穩(wěn)定細(xì)胞系的建立

DU145細(xì)胞接種于直徑為10,cm的培養(yǎng)皿，等細(xì)胞鋪展度達(dá)到60%～70%，用500,μL慢病毒收集液侵染細(xì)胞．陰性對(duì)照組用scramble慢病毒收集液侵染DU145細(xì)胞．24,h后更換含0.5,μg/mL嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行篩選．此后，待單克隆長(zhǎng)至肉眼可見，挑起，轉(zhuǎn)移至新的平板繼續(xù)培養(yǎng)，然后收集細(xì)胞，檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系是否建立成功．

1.2.3 免疫印跡檢測(cè)Nedd4蛋白表達(dá)

收集慢病毒侵染后及陰性對(duì)照組DU145細(xì)胞，離心棄上清液后，加入50,μL 強(qiáng)RIPA細(xì)胞裂解液，于冰浴中裂解20,min，然后于4,℃、13,000,r/min離心10,min．離心后棄沉淀，取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳．電泳完畢，利用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉室溫封閉1,h，于4,℃下進(jìn)行一抗孵育過夜．然后用體積分?jǐn)?shù)為0.02%的Tween 20的PBS緩沖液(PBST)漂洗PVDF膜3～5次，每次5,min．洗完后于室溫下二抗避光孵育1,h．PBST漂洗3～5次，每次5,min．洗完后，用Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)成像，以β-actin作對(duì)照．1.2.4 MTT檢測(cè)干擾Nedd4表達(dá)對(duì)DU145細(xì)胞增

殖的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照組與Nedd4 shRNA實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組取干擾Nedd4表達(dá)的DU145穩(wěn)定細(xì)胞系，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔．96孔板每孔5×103個(gè)細(xì)胞，用MTT法分別于48、72、96,h用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570,nm處吸光度(A)以反映細(xì)胞增殖狀況．

1.2.5 DAPI染色檢測(cè)下調(diào)Nedd4表達(dá)對(duì)DU145細(xì)胞凋亡的影響

取干擾Nedd4表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系與陰性對(duì)照scramble細(xì)胞，接種細(xì)胞于蓋玻片上，用1.5,μmol/L星形孢菌素分別處理24、48,h；處理完畢后，取出蓋玻片，用PBS溶液洗2遍；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定5,min，再用PBS洗2次；用體積分?jǐn)?shù)為0.2%的Triton,X-100處理10,min，處理完畢后用PBS洗2次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的BSA封閉30,min；封閉完成后，用DAPI染細(xì)胞核，室溫閉光靜置30,min后，用PBS洗3次，最后用封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察．

2 結(jié)果與分析

2.1 shRNA干擾載體的慢病毒包裝及檢測(cè)

為了檢測(cè)不同序列shRNA下調(diào)Nedd4蛋白表達(dá)的效果，對(duì)shRNA干擾載體進(jìn)行慢病毒包裝并侵染DU145細(xì)胞，免疫印跡檢測(cè)DU145細(xì)胞內(nèi)Nedd4蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖1所示．

圖1中control為空白對(duì)照，不含慢病毒；scramble為陰性對(duì)照，是以含非靶基因shRNA的pLKO.1載體進(jìn)行慢病毒包裝所得；2424、2425、2476、2477、4755為Nedd4靶基因shRNA的pLKO.1載體進(jìn)行慢病毒包裝所得．如圖1所示，序列2425慢病毒收集液對(duì)細(xì)胞內(nèi)Nedd4蛋白表達(dá)干擾效果最好，序列2424和2477干擾效果次之，序列2476和4755干擾效果最差．所以選用序列2425慢病毒收集液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)．

2.2 下調(diào)Nedd4表達(dá)的DU145穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立

為了檢測(cè)下調(diào)Nedd4表達(dá)的DU145穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系是否構(gòu)建成功，進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示．與對(duì)照相比，用Nedd4 shRNA干擾載體慢病毒侵染的DU145穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中Nedd4表達(dá)量降低，即干擾Nedd4表達(dá)的DU145穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功．

2.3 下調(diào)Nedd4表達(dá)對(duì)DU145細(xì)胞增殖的影響

利用MTT方法檢測(cè)下調(diào)Nedd4表達(dá)對(duì)DU145細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖3所示．

由圖3可知：各組細(xì)胞在接種后的96,h，下調(diào)Nedd4的DU145細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照組(P＜0.01)，說明下調(diào)Nedd4表達(dá)可以抑制DU145細(xì)胞增殖．

2.4 下調(diào)Nedd4表達(dá)對(duì)DU145細(xì)胞凋亡的影響

凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核皺縮、形狀不規(guī)則，熒光染色較正常細(xì)胞核濃，有些還會(huì)碎裂成塊狀．利用DAPI染色技術(shù)檢測(cè)下調(diào)Nedd4的表達(dá)對(duì)DU145細(xì)胞凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示．在接受星形孢菌素處理后，穩(wěn)定干擾Nedd4表達(dá)的DU145細(xì)胞核皺縮量明顯多于陰性對(duì)照組；且48,h后，穩(wěn)定干擾Nedd4表達(dá)的DU145細(xì)胞由于凋亡過多，視野中總細(xì)胞量減少．這些結(jié)果都說明下調(diào)Nedd4表達(dá)可以促進(jìn)DU145細(xì)胞凋亡．

3 討 論

前列腺癌是在男性群體中比較常見的一種癌癥．研究[12]表明，Nedd4作為泛素連接酶家族中的一員，影響前列腺癌細(xì)胞的增殖與凋亡．

本研究采用的慢病毒載體系統(tǒng)是三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，分別為包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒和載體質(zhì)粒．這個(gè)系統(tǒng)利用多質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建載體并且盡量減少質(zhì)粒間重疊數(shù)量，這樣可以大大降低通過重組產(chǎn)生可復(fù)制性病毒的可能性，提高了慢病毒載體的安全性．

利用慢病毒載體系統(tǒng)包裝慢病毒，然后侵染DU145細(xì)胞，結(jié)果證實(shí)Nedd4的shRNA干擾序列TRCN0000272425成功下調(diào)了DU145細(xì)胞的Nedd4

蛋白表達(dá)，且利用該序列包裝的慢病毒收集液成功構(gòu)建干擾Nedd4表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系(圖1和圖2)．

原癌基因可以通過抑制細(xì)胞增殖或者促進(jìn)細(xì)胞凋亡來影響腫瘤的生長(zhǎng)．MTT實(shí)驗(yàn)表明，干擾Nedd4表達(dá)后，DU145細(xì)胞的增殖能力較對(duì)照組降低，說明Nedd4能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖(圖3)．DAPI染色結(jié)果顯示，下調(diào)Nedd4表達(dá)后，前列腺癌細(xì)胞對(duì)星形孢菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性明顯增強(qiáng)，說明下調(diào)Nedd4能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡(圖4)．

Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著重要作用，其中Caspase-3作為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能．Nedd4影響細(xì)胞凋亡的過程中，是否發(fā)生了Caspase-3酶原的激活及剪切，還有待進(jìn)一步研究．

PTEN作為抑癌基因，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、死亡方面起著重要作用[13-14]．在多種人類細(xì)胞和組織中，PTEN的突變或敲除促進(jìn)腫瘤發(fā)生[15]．PTEN負(fù)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路[16]，能夠被泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解，在老鼠的模型及多種人類癌癥樣本中，PTEN的表達(dá)水平均明顯低于正常細(xì)胞表達(dá)量，與此同時(shí)，Nedd4-1高表達(dá)[17-18]，表明Nedd4-1對(duì)PTEN具有負(fù)調(diào)控作用．

相反，也有研究[19]表明敲除Nedd4-1后，并不影響PTEN的降解與它的亞細(xì)胞定位．Eide等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Nedd4在結(jié)腸癌細(xì)胞中高表達(dá)，并且促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，但是并不依賴PI3K/PTEN/Akt信號(hào)通路，PTEN表達(dá)量與Nedd4沒有直接關(guān)系．這對(duì)于進(jìn)一步證實(shí)Nedd4是否作為PTEN的負(fù)調(diào)控因子并且影響PTEN降解與核轉(zhuǎn)移是一個(gè)挑戰(zhàn)．

Nedd4參與生長(zhǎng)因子受體的調(diào)控，包括胰島素生長(zhǎng)因子受體-1(IGF-1,R)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(VEGF-R2)、上皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)等[22-23]. Nedd4敲除后的轉(zhuǎn)基因小鼠的主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)阻滯，同時(shí)小鼠胚胎成纖維母細(xì)胞(MEFs)在敲除Nedd4后生長(zhǎng)緩慢，并且在血清饑餓處理后，相對(duì)于野生型細(xì)胞，敲除Nedd4的MEFs反應(yīng)異常[24]．

Nedd4蛋白家族擁有9個(gè)成員，9個(gè)成員分別有各自的功能，例如：除Nedd4-1、Nedd4-2以外，Smurf1調(diào)控腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、BMP/Smad1通路等；Smurf2通過Smad2和TGF-β 受體抑制TGF-β 信號(hào)通路，從而介導(dǎo)完成泛素化降解[25–26]；ITCH作為細(xì)胞命運(yùn)調(diào)節(jié)因子Notch，調(diào)控細(xì)胞活動(dòng)；WWP1參與p53的定位與轉(zhuǎn)錄；WWP2是上皮鈉離子通道；NEDL1是超氧化物歧化酶1的突變體；NEDL2負(fù)責(zé)穩(wěn)定p73及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控等[27]．這9個(gè)家族成員在各自主要功能以外是否存在相互之間的功能補(bǔ)充還需要大量的研究來尋求答案．

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責(zé)任編輯：周建軍

Effects of Ubiquitin Ligase Nedd4 on Human Prostate Cancer Cell Proliferation and Apoptosis

ZHOU Jie，LI Yuyin，ZHAO Changcai，DIAO Aipo
(College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

To study the effects of Nedd4 on tumor cell proliferation and apoptosis，Nedd4 was depleted in prostate cancer cell DU145 by infecting the lentiviruses expression of Nedd4-shRNAs. MTT assay showed that that depletion of Nedd4 decreased DU145 cell proliferation. DAPI staining indicated that knockdown of Nedd4 resulted in greater sensitivity to staurosporine-induced apoptosis of DU145 cells. These results revealed that the down-regulation of Nedd4 expression not only reduced the cell proliferation but also induced the apoptosis of DU145 cells.

Nedd4；prostate cancer cell；cell proliferation；cell apoptosis

R737.25

A

1672-6510(2014)05-0015-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.05.004

2013–12–18；

2014–03–31

天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(10JCZDJC16800)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31071181)

周 潔（1987—），女，江蘇徐州人，碩士研究生；通信作者：刁愛坡，教授，diaoaipo@tust.edu.cn.