陳俊亮，張慧蕓，田 芬，霍貴成，康懷彬

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；3.杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司研究院，浙江 杭州 310018）

乳酸乳球菌是乳球菌屬最重要和最典型的1個(gè)種，包含乳酸乳球菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種[1-2]，被用作乳品發(fā)酵劑具有悠久的歷史[3-4]，主要用于生產(chǎn)干酪、黃油和酪乳[5]。在乳制品發(fā)酵工業(yè)中，乳酸乳球菌可將牛奶中的乳糖發(fā)酵形成乳酸，進(jìn)而產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)雙乙酰和乙醛[6]，并在干酪成熟過程中，其胞內(nèi)肽酶和胞外蛋白酶可促進(jìn)干酪中蛋白質(zhì)水解，對成熟干酪風(fēng)味物質(zhì)形成具有重要作用[7]。

乳酸乳球菌菌粉制備通常采用真空冷凍干燥技術(shù)，但在凍干過程中會(huì)導(dǎo)致部分菌體細(xì)胞的損傷或死亡，以及某些蛋白酶分子鈍化，從而造成發(fā)酵活力下降[8]。通過添加保護(hù)劑可有效地減少冷凍干燥對乳酸菌傷害，在直投式發(fā)酵劑制備過程中具有重要作用[9]。

本實(shí)驗(yàn)以內(nèi)蒙古自治區(qū)發(fā)酵乳中的乳酸乳球菌乳脂亞種KLDS4.0326為研究目標(biāo)[10]，首先采用單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究不同凍干保護(hù)劑對菌體細(xì)胞存活率的影響，篩選關(guān)鍵因素，再利用最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定主要影響因素的最佳質(zhì)量濃度，以提高真空冷凍干燥過程中菌體細(xì)胞的存活率，為開發(fā)新型干酪菌種保護(hù)劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸乳球菌乳脂亞種KLDS4.0326 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)微生物菌種保藏中心（KLDSDICC）。

MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、蛋白胨5 g/L、牛肉膏5 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖20 g/L、吐溫-80 1mL/L、乙酸鈉5 g/L、硫酸錳0.25 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L，pH 6.8，121 ℃滅菌15 min。固體培養(yǎng)基添加15 g/L瓊脂。

脫脂乳粉 德國 Nordmilch AG公司；海藻糖 上海華精生物高科技有限公司；VC 上海晶純試劑有限公司；蔗糖、乳糖、谷氨酸鈉、甘油 天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；脫脂乳粉、海藻糖和谷氨酸鈉為食品級；其他均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KLF2000型發(fā)酵罐 瑞士比歐生物工程公司；Christ Alpha 1-4型凍干機(jī) 德國Marin Christ公司；ES-2030型冷凍干燥儀 日本Hitachi公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 上海離心機(jī)械研究所；SPX-150B生化培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；HVE-50型高壓滅菌器 日本Hirayama公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的培養(yǎng)與收集

乳酸乳球菌乳脂亞種KLDS4.0326經(jīng)過活化后，以4%接種量接種到發(fā)酵罐中，恒溫培養(yǎng)至穩(wěn)定期前期，在4 ℃條件下4 500 r/min離心15 min，收集菌體。

1.3.2 真空冷凍干燥工藝

用等體積0.85 g/100 mL無菌生理鹽水充分懸浮混合菌體，接著4 ℃離心收集菌體，然后等體積加入不同質(zhì)量濃度的保護(hù)劑于安培瓶中；樣品先放置在-80 ℃預(yù)冷凍24 h后，再放入真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，通過菌體細(xì)胞存活率反映保護(hù)劑的保護(hù)效果[11]。

1.3.3 活菌計(jì)數(shù)

采用梯度稀釋平板活菌計(jì)數(shù)法[12]，恒溫培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

1.3.4 菌體細(xì)胞存活率計(jì)算

1.3.5 保護(hù)劑篩選單因素試驗(yàn)

選取脫脂乳粉、谷氨酸鈉、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘油、硫酸錳和VC作為凍干保護(hù)劑，將上述8 種物質(zhì)用蒸餾水分別配制成以下質(zhì)量濃度的溶液：乳粉、蔗糖、乳糖、海藻糖分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0 g/100 mL，甘油為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g/100 mL，谷氨酸鈉1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/100 mL，VC為0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 g/100 mL，硫酸錳為0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 g/100 mL。脫脂乳粉115 ℃保溫殺菌10 min[13]；甘油、硫酸錳121 ℃保溫殺菌15 min；VC、蔗糖、乳糖、海藻糖、谷氨酸鈉溶液采用0.22 μm膜過濾除菌[14]，冷卻后置于4 ℃冰箱備用，以滅菌蒸餾水作為對照，測定凍干前后活菌數(shù)，計(jì)算菌體細(xì)胞存活率。

1.3.6 Plackett-Burman析因試驗(yàn)

利用Design-Expert軟件進(jìn)行Plackett-Burman析因設(shè)計(jì)，選擇次數(shù)為N=12的實(shí)驗(yàn)，對8 種保護(hù)劑進(jìn)行效應(yīng)分析，每個(gè)因素分別取-1、＋1兩個(gè)水平，設(shè)定高水平為低水平的1.5 倍，響應(yīng)值為凍干后的細(xì)胞存活率。

1.3.7 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)析因試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)路徑[15]，按照一定梯度增加脫脂乳粉的質(zhì)量濃度，降低海藻糖和甘油的質(zhì)量濃度，其他5個(gè)因素均固定為初始質(zhì)量濃度，檢測凍干后菌體細(xì)胞存活率的變化，以確定3個(gè)因素的最適質(zhì)量濃度范圍。

1.3.8 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)

以菌體存活率Y為響應(yīng)值，采用Box-Behnken方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立二次響應(yīng)面回歸模型，以尋求最優(yōu)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)選用三因素三水平共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面法試驗(yàn)，其中析因部分試驗(yàn)次數(shù)為12 次，中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)次數(shù)為5 次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

1.3.9 凍干菌粉的貯藏穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

使用最佳保護(hù)劑制備凍干菌粉，將其分別放置于4 ℃和25 ℃保存12 個(gè)月，每隔30 d測定菌體細(xì)胞存活率，平行3 次實(shí)驗(yàn)，檢測菌粉的貯藏穩(wěn)定性[16]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均為3個(gè)重復(fù)樣品的平均值，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，判斷彼此間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同凍干保護(hù)劑對乳酸乳球菌凍干存活率的影響

對不同質(zhì)量濃度的8種保護(hù)劑及不加保護(hù)劑的對照組進(jìn)行單因素試驗(yàn)，通過測定乳酸乳球菌乳脂亞種KLDS4.0326在凍干前后活菌數(shù)，比較不同保護(hù)劑對菌體的保護(hù)效果，結(jié)果見圖1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Plackett-Burman experimental design and corresponding response of cell survival rate

圖1 不同凍干保護(hù)劑對乳酸乳球菌乳脂亞種KLDS4.0326凍干存活率的影響Fig.1 Effect of different cryoprotectants on the survival rate of Lactococcus lactis subsp.cremoris KLDS 4.0326

由圖1可知，未添加保護(hù)劑的乳酸乳球菌乳脂亞種KLDS4.0326凍干存活率為7.53%，當(dāng)添加8 種單一保護(hù)劑后，均對其產(chǎn)生保護(hù)效果。由圖中曲線變化趨勢可知，隨著保護(hù)劑添加量的增加，菌體的存活率不斷提高。當(dāng)單一保護(hù)劑脫脂乳粉、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘油、谷氨酸鈉、VC、硫酸錳的質(zhì)量濃度分別為8.0、10.0、10.0、8.0、4.0、3.0、0.9、0.7 g/100 mL時(shí)，菌體存活率分別達(dá)到最高值：48.26%、33.43%、31.25%、36.92%、42.02%、34.36%、18.12%和21.52%，此后繼續(xù)增加保護(hù)劑質(zhì)量濃度，保護(hù)效果反而呈現(xiàn)降低趨勢，這是由于高質(zhì)量濃度的保護(hù)劑會(huì)加速細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)聚合，形成較強(qiáng)玻璃化結(jié)構(gòu)，反而不利于菌體細(xì)胞的保存，并且復(fù)水效果不理想，因此，當(dāng)保護(hù)劑質(zhì)量濃度超過它們的最佳質(zhì)量濃度后，菌體存活率隨著各種保護(hù)劑添加量的增加反而下降[17]。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)篩選主要影響因素

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。利用Design-Expert軟件對表1中的細(xì)胞存活率數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到各影響因子的偏回歸系數(shù)及其顯著性（表2）。

由表1可知，脫脂乳粉、谷氨酸鈉、蔗糖、硫酸錳對細(xì)胞存活率的影響為正效應(yīng)，而其他因素產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)。脫脂乳粉和海藻糖對菌體存活率的影響高度顯著（P＜0.01），甘油對菌體存活率的影響顯著（P＜0.05），其他因素差異不顯著，因此選取脫脂乳粉、海藻糖、甘油3個(gè)因素作為研究對象。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素的效應(yīng)評價(jià)Table 2 Estimated effects of Plackett-Burman design

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果和中心試驗(yàn)點(diǎn)的確定

根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)路徑，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，4號試驗(yàn)中脫脂乳粉、海藻糖、甘油的質(zhì)量濃度分別為10.5、7.5、3.0 g/100 mL時(shí)，菌體細(xì)胞存活率達(dá)到最大值84.05%，然后隨著質(zhì)量濃度的變化細(xì)胞存活率逐漸降低。結(jié)果表明，4號試驗(yàn)中3個(gè)因素的質(zhì)量濃度接近最大響應(yīng)區(qū)域，因此將其作為中心組合試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Steepest ascent experimental design and corresponding results

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化最佳保護(hù)劑配比

2.4.1 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果及回歸方程方差分析

Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果見表4，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，回歸方程的方差分析結(jié)果如表5所示。

表4 Box-Behnken優(yōu)化設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Box-Behnken design and corresponding results

將所有數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得菌體細(xì)胞存活率對編碼自變量脫脂乳粉、海藻糖和甘油的二次多項(xiàng)回歸方程為：

從模型的方差分析表可知，本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度顯著性（PModel＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（PLotoffit＝0.116 1），其校正決定系數(shù)為R2Adj＝0.984 6，說明有98.46%的菌種細(xì)胞存活率變化能由此模型進(jìn)行解釋；相關(guān)系數(shù)為R2＝0.993 2，說明模型對實(shí)際情況擬合較好，可用此模型對細(xì)胞存活率進(jìn)行分析和預(yù)測。

表5 回歸方程方差分析Table 5 Analysis of variance for the regression equation

2.4.2 響應(yīng)面圖及等高線圖分析

利用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)得到的響應(yīng)面圖和等高線圖，可直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響，以及在反應(yīng)過程中的交互作用影響。在等高線圖中，橢圓型或者馬鞍型的等高線表示因素之間交互作用顯著，而圓型的等高線表示因素之間交互作用較弱。由圖2可知，脫脂乳粉與海藻糖、海藻糖與甘油對菌體存活率影響的交互作用高度顯著，而脫脂乳粉與甘油的交互作用不顯著。

圖2 各因素及交互作用對菌體存活率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plot showing the effects of different factors and their interaction on cell survival rate

2.4.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過Design-Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以獲得最大菌體存活率為目標(biāo)，計(jì)算得到的最佳配方質(zhì)量濃度為：脫脂乳粉10.77 g/100 mL、海藻糖7.81 g/100 mL、甘油3.31 g/100 mL，在此基礎(chǔ)上得到菌體細(xì)胞存活率理論預(yù)測值為89.12%。使用最佳保護(hù)劑配比進(jìn)行9 組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，菌體細(xì)胞存活率達(dá)到（87.43±1.62）%，實(shí)測值與預(yù)測值相近，說明響應(yīng)面法建立的數(shù)學(xué)模型較準(zhǔn)確可靠。

2.5 菌粉的保存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 KLDS4.0326凍干菌粉在4℃和25℃條件下保存期間菌體細(xì)胞存活率的變化Fig.3 Changes in cell survival rate of KLDS 4.0326 with storage time at 4 and 25 ℃

制備的乳酸乳球菌乳脂亞種KLDS4.0326菌粉分別在4 ℃和25 ℃條件下保存12 個(gè)月，由圖3可知，隨著保存時(shí)間的增加，活菌數(shù)均呈現(xiàn)下降趨勢，但是25 ℃貯藏時(shí)存活率下降更明顯，在第12個(gè)月末檢測兩種保藏溫度下的活菌數(shù)分別為1.04×109CFU/g和2.19×108CFU/g，均保持較高的活菌數(shù)；兩種保藏溫度下菌體細(xì)胞的存活率分別為40.63%和8.67%，結(jié)果表明4 ℃貯藏條件下的保存效果優(yōu)于25 ℃。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)中脫脂乳粉、海藻糖、甘油、谷氨酸鈉對乳酸乳球菌乳脂亞種KLDS4.0326凍干保護(hù)效果顯著，這是因?yàn)樵谡婵绽鋬龈稍镞^程中，乳清蛋白能在菌體外形成蛋白膜，對細(xì)胞加以保護(hù)，并可以固定凍干的酶類，防止由于細(xì)胞壁蛋白質(zhì)損壞而引起的胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，而且乳中其他成分（如乳糖等）同樣可以提高菌體的凍干存活率[18]。

目前主要有兩種假說解釋海藻糖穩(wěn)定生物分子的機(jī)理：一種是“水替代”假說，生物體大分子由一層水膜所包圍，這層水膜對維持生物大分子的功能及結(jié)構(gòu)起到至關(guān)重要的作用，當(dāng)生物大分子失去維持其結(jié)構(gòu)和功能特性的水膜時(shí)，海藻糖可在生物大分子失水部位以氫鍵的形式連接，形成一層保護(hù)膜以代替失去的結(jié)構(gòu)水膜；另一種是“玻璃態(tài)”假說，該假說認(rèn)為通過海藻糖玻璃化轉(zhuǎn)變的趨勢，導(dǎo)致無定形連續(xù)相的形成，在這種結(jié)構(gòu)中分子運(yùn)動(dòng)和分子變性反應(yīng)非常微弱[19-20]。

甘油屬于多元醇類，是一類應(yīng)用較為普遍的凍干保護(hù)劑。由于醇和糖類相似都具有羥基官能團(tuán)，均能產(chǎn)生“優(yōu)先水化作用”以及改變體系的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度等，因此在發(fā)揮保護(hù)效果方面與糖類具有一定共性。此外，甘油具有良好滲透能力，可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與胞內(nèi)大分子形成氫鍵，以取代干燥脫除的水分，從而維持蛋白質(zhì)、碳水化合物及脂肪等大分子活性物質(zhì)的原有結(jié)構(gòu)。此外，甘油還可起到降低細(xì)胞脫水皺縮和緩解復(fù)水腫脹的效果[21]。Savini等[22]利用甘油、甘露醇、山梨糖醇及其他添加劑作為凍干保護(hù)劑對鼠李糖乳桿菌和乳酸桿菌的冷凍干燥過程進(jìn)行研究，得出多元醇類作為保護(hù)劑提高菌體細(xì)胞凍干存活率效果良好，并且甘油的穩(wěn)定效果最顯著。

單一保護(hù)劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VC和硫酸錳也能夠增強(qiáng)KLDS4.0326菌體細(xì)胞存活率，這是由于VC不僅是碳水化合物，其羥基與磷脂的磷酸基團(tuán)連接形成氫鍵，從而阻止和限制細(xì)胞膜因失水而融合，而且它是一種滲透性物質(zhì)，可以氫鍵形式或其他方式與膜上的磷脂極性端結(jié)合，從而取代水分保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性[23]。而硫酸錳在凍干保護(hù)劑中作為緩沖鹽，能夠滲透到細(xì)胞內(nèi)部從而調(diào)節(jié)菌體內(nèi)部理化平衡，同時(shí)還能與保護(hù)劑中的其他成分產(chǎn)生聯(lián)合作用，從而更好的對凍干菌體起到保護(hù)作用[24]。Desmons[25]在乳酸菌凍干機(jī)理研究中發(fā)現(xiàn)，在脫脂乳和甘油為基礎(chǔ)保護(hù)劑的配方中添加量為0.1%硫酸錳后，能夠使嗜酸乳桿菌凍干存活率由83%提高到92%。因此硫酸錳在凍干過程中對乳酸菌起到了重要的保護(hù)作用。

在真空冷凍干燥過程中，單一的保護(hù)劑不能滿足生產(chǎn)工藝要求，一般使用復(fù)合凍干保護(hù)劑。復(fù)合保護(hù)劑中各成分在冷凍干燥中均發(fā)揮著各自的作用，同時(shí)相互間又具有協(xié)同作用，只有各組分在比例和濃度達(dá)到協(xié)調(diào)時(shí)，凍干保護(hù)劑才具備最佳效果[26]。

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