唐文靜，呂維富，王亞光，朱先海，杜丹丹，魯 東，周春澤

兔肝VX2瘤射頻消融后不同區(qū)帶PCNA mRNA和VEGF表達

唐文靜，呂維富，王亞光，朱先海，杜丹丹，魯 東，周春澤

目的研究兔肝VX2瘤射頻消融（RFA）后不同區(qū)帶增殖細胞核抗原（PCNA）mRNA和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達，觀察其對凋亡和增殖的影響。方法將48只實驗兔制成VX2肝移植腫瘤模型，分成RFA組（42只）及對照組（6只），分別于RFA后即刻、1 d、2 d、1周、2周、3周后處死，對肝移植腫瘤組織通過HE染色、Annexin V-FITC／PI標記、PCNA mRNA及VEGF檢測來觀察不同時期不同區(qū)帶的腫瘤細胞凋亡及增殖。結(jié)果對照組VX2腫瘤呈浸潤性生長。RFA組術(shù)后中央消融區(qū)呈大片壞死，邊界區(qū)見炎性反應細胞及殘留癌細胞；RFA組術(shù)后中央消融區(qū)內(nèi)即刻出現(xiàn)大量壞死細胞，以針道區(qū)為主，壞死百分率約（45.16± 4.44）%；3周后針道區(qū)壞死率仍明顯高于熱凝固區(qū)及邊界區(qū)（F＝142.089，P＝0.000），此時，各區(qū)帶內(nèi)腫瘤細胞凋亡率均明顯下降，接近術(shù)前水平；針道區(qū)在1 d后PCNA mRNA一直維持低表達水平；熱凝固區(qū)在3周后PCNA mRNA表達恢復到術(shù)前對照水平（P＝0.159）；邊界區(qū)的PCNA mRNA表達在2周時較1周時明顯升高（P＝0.000），但仍低于術(shù)前對照組（P＝0.001），3周后邊界區(qū)PCNA mRNA的表達則高于術(shù)前對照組（P＝0.031）；RFA后邊界區(qū)VEGF表達水平明顯高于針道區(qū)及熱凝固區(qū)（P＜0.05）。結(jié)論RFA對針道細胞可以達到完全殺滅，但對于邊界區(qū)的殘留，RFA可能促進其復發(fā)及轉(zhuǎn)移，仍需要進一步治療。

射頻消融；VX2腫瘤；細胞凋亡；細胞增殖；增殖細胞核抗原；血管內(nèi)皮生長因子

射頻消融術(shù)（radiofrequency ablation，RFA）已成為原發(fā)或繼發(fā)性肝癌局部治療的重要手段之一。臨床實踐和實驗研究［1］顯示，RFA可明顯抑制射頻針周邊區(qū)域腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移，但也有研究者報道單次RFA治療肝癌的殘癌發(fā)生率在3%～52%［2］，因此，有必要研究和探討肝癌RFA后殘瘤細胞活性的變化規(guī)律。該課題研究RFA對兔肝VX2瘤射頻消融區(qū)內(nèi)不同區(qū)帶增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）mRNA和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達，藉以評價腫瘤細胞的凋亡和增殖，以利于在肝癌RFA治療中獲得足夠的“安全邊界”，減少射頻治療后腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移的風險，為臨床提高肝癌RFA的效果提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料48只新西蘭大白兔，由安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院實驗動物中心提供，雌雄不限，體重（2.3±0.3）kg。瘤苗由蘇州大學醫(yī)學院提供。

1.2 VX2肝移植瘤模型制作切取VX2瘤腫瘤邊緣生長旺盛區(qū)腫塊，剪成近1 mm×1 mm×1 mm大小的瘤塊，置于RPMI 1640營養(yǎng)液中備用。將48只實驗兔以3%戊巴比妥鈉30 mg／kg經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉生效后于劍突下正中偏左作一長3 cm的正中偏左3 cm的縱行切口，逐層進腹，用眼科鑷將備用瘤組織塊置入肝臟左葉，以明膠海綿填塞止血，再依次縫合切口，即制成兔肝VX2腫瘤模型。

1.3 分組及處理在瘤塊植入后10 d至2周內(nèi)行超聲檢查，待腫瘤直徑達（2.5±0.5）cm，隨機分為兩組：對照組（6只）直接處死取肝臟標本；RFA組（42只），麻醉后，行開腹下RFA治療（消融條件：電壓50 V，消融時間12 min，針尖溫度60～90℃），分別于術(shù)后即刻、1 d、2 d、1周、2周、3周處死瘤兔取肝臟標本。根據(jù)殘瘤大體病理標本取靶區(qū)中針道區(qū)、熱凝固區(qū)及邊界區(qū)組織，分4份分別行HE染色、Annexin V-FITC／PI標記、PCNA mRNA表達及VEGF表達的檢測。

1.4 統(tǒng)計學處理使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。對正態(tài)分布和方差齊性的計量資料采用t檢驗和方差分析；對非正態(tài)分布和方差不齊的計量資料采用非參數(shù)的秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兔肝VX2瘤的組織病理學改變對照組腫瘤成圓形或分葉狀，無明顯包膜，切面成血肉狀，部分病灶中心可見液化、壞死；RFA組消融灶由內(nèi)向外分別為灰白色針道區(qū)、熱凝固區(qū)及暗紅色消融邊界

區(qū)，見圖1A。對照組肝組織VX2瘤成浸潤性生長，細胞體積大，形態(tài)不規(guī)則，核大小不一，深染，核仁明顯。RFA組消融后，針道區(qū)及熱凝固區(qū)內(nèi)見大量腫瘤細胞壞死；消融邊界區(qū)見大量中性粒細胞、淋巴細胞及紅細胞聚集，外圍為殘存的腫瘤細胞，與對照組形態(tài)類似，見圖1B～1E。

圖1 兔肝VX2瘤RFA后病理學改變

2.2 各組腫瘤組織細胞不同區(qū)帶壞死及凋亡規(guī)律變化情況采用Annexin V-FITC／PI檢測分析，術(shù)后靶區(qū)3周內(nèi)即刻出現(xiàn)大量壞死細胞，以針道區(qū)為主，壞死百分率約（45.16±4.44）%；3周后針道區(qū)壞死率仍明顯高于熱凝固區(qū)和邊界區(qū)（F＝142.089，P＝0.000），見圖2。不同區(qū)帶均在術(shù)后1 d達到凋亡高峰，以邊界區(qū)為主，凋亡率達到（56.28±4.91）%。3周后各區(qū)帶內(nèi)腫瘤細胞凋亡率均明顯下降，接近術(shù)前水平，見圖3。

圖2 不同區(qū)帶兔肝VX2腫瘤細胞壞死率與時間的關(guān)系（術(shù)前對照組壞死率為3.1%）

圖3 不同區(qū)帶兔肝VX2腫瘤細胞凋亡率與時間之間的關(guān)系［術(shù)前對照組凋亡率（4.05±0.29）%］

2.3 RT-PCR檢測PCNA mRNA表達情況利用BIO-RAD凝膠成像儀對產(chǎn)物進行半定量分析，運用Bandscan軟件進行計算RT-PCR產(chǎn)物電泳帶的亮度和面積，即mRNA相對水平＝（RT-PCR產(chǎn)物電泳帶亮度×面積）／（Gapdh RT-PCR產(chǎn)物電泳帶亮度×面積）。結(jié)果顯示：對照組及消融靶區(qū)內(nèi)各區(qū)帶不同時間的檢測數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計學意義（針道區(qū)：F＝58.531，P＝0.000；熱凝固區(qū)：F＝27.513，P＝0.000；消融邊界區(qū)F＝59.766，P＝0.000）。其中針道區(qū)在1 d后PCNA mRNA一直維持低表達水平；熱凝固區(qū)在3周后恢復到術(shù)前對照水平（P＝0.159）；邊界區(qū)在2周時較1周時明顯升高（P＝0.000），但仍低于術(shù)前對照組（P＝0.001），3周后邊界區(qū)PCNA mRNA的表達量則高于術(shù)前對照組（P＝0.031）；各區(qū)帶之間比較在2 d后有明顯差別，其中以針道區(qū)表達最弱，邊界區(qū)表達最強（2 d：F＝29.562，P＝0.000；1周：F＝55.221，P＝0.000；2周：F＝86.474，P＝0.000；3周：F＝101.187，P＝0.000），見圖4。

2.4 免疫組化法檢測VEGF分別取對照組及RFA組術(shù)后不同時間段不同消融帶組織，檢測其VEGF值，免疫陽性的細胞表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)及胞膜黃染，結(jié)果對照組腫瘤組織內(nèi)VEGF呈現(xiàn)高表達，尤以腫瘤邊緣為主；針道區(qū)及凝固壞死區(qū)VEGF值明顯降低，兩者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；邊界區(qū)VEGF值較術(shù)前升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 RFA術(shù)前及術(shù)后各區(qū)帶VEGF表達（±s）

表1 RFA術(shù)前及術(shù)后各區(qū)帶VEGF表達（±s）

與RFA術(shù)前比較：*P＜0.05

項目術(shù)前術(shù)后1 d術(shù)后3 d術(shù)后1周術(shù)后2周術(shù)后3周針道區(qū)0.62±0.120.23±0.080.25±0.070.18±0.050.20±0.080.21±0.11熱凝固區(qū)0.58±0.070.22±0.110.24±0.050.19±0.060.25±0.110.30±0.06周邊區(qū)0.63±0.192.15±0.14*2.31±0.05*2.40±0.17*2.16±0.17*1.85±0.09*

圖4 參照組、針道區(qū)、熱凝固區(qū)、周邊區(qū)PCNA mRNA（635 bp）瓊脂糖凝膠電泳條帶

3 討論

本實驗通過HE細胞染色及Annexin V-FITC／PI法分析兔肝VX2瘤RFA后靶區(qū)內(nèi)不同區(qū)帶腫瘤細胞損傷及其變化情況。發(fā)現(xiàn)RFA后針道區(qū)即刻出現(xiàn)大量凝固性壞死［壞死率（45.16±4.44）%］，邊界區(qū)則以腫瘤細胞凋亡為主，壞死和凋亡持續(xù)約2周左右，3周后凝固區(qū)和邊界區(qū)的壞死率及凋亡率接近術(shù)前水平，對于RFA后針道區(qū)周邊區(qū)域一定時間內(nèi)存在一個持續(xù)凋亡的過程，這可能與凝固壞死的腫瘤組織仍留在體內(nèi)，使腫瘤細胞的表面腫瘤抗原決定簇暴露，增加了腫瘤抗原的免疫原性，隨之刺激機體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生一系列特異性和非特異性抗腫瘤免疫，使之具有所謂的“瘤苗”作用。有研究［2］顯示RFA作為一種熱療除能夠直接損傷細胞致其壞死或凋亡，還能夠增加機體免疫細胞和免疫因子并且將各種免疫細胞、免疫因子調(diào)回正常的比例和狀態(tài)，使機體朝著有利于清除腫瘤細胞的方向發(fā)展。

腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能、復發(fā)與腫瘤細胞的增殖活性有顯著相關(guān)性。丁學梅等［3］發(fā)現(xiàn)PCNA的表達與肝癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，Hendriksen et al［4］發(fā)現(xiàn)PCNA活性越高，腫瘤侵襲性越強，發(fā)生轉(zhuǎn)移率更高，因此肝癌中PCNA mRNA的水平可以很好的預示著肝癌細胞的增殖和侵襲能力。腫瘤血管生成的增加繼發(fā)于VEGF表達的增加，從而促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［5］，該實驗檢測出術(shù)后消融周邊區(qū)帶1 d后PCNA mRNA表達與對照組對比明顯降低，熱凝固區(qū)及邊界區(qū)內(nèi)PCNA mRNA表達量分別在1周和2周后開始升高，其中邊界區(qū)3周后表達量高于對照組?？赡芘c瘤體邊緣的“烤箱效應”及“熱流失效應”導致瘤體外周溫度不足有關(guān)，雖對腫瘤細胞增殖能力短時間抑制，但隨時間發(fā)展出現(xiàn)增殖能力恢復并高于術(shù)前對照的情況。VEGF檢測結(jié)果與此類似，可能與RFA后腫瘤內(nèi)毛細血管變脆易在高溫下破裂有關(guān)。3周后邊界區(qū)VEGF升高可能與血管內(nèi)微血栓形成，腫瘤組織缺血、缺氧，上調(diào)VEGF的表達，誘導形成新生腫瘤血管有關(guān)。

無論是手術(shù)切除還是包括RFA在內(nèi)的局部微創(chuàng)治療，其治療效果與術(shù)后是否有腫瘤殘留及腫瘤血管生成情況密切相關(guān)［6］。有研究［7］顯示：RFA治療肝癌后，復發(fā)后的腫瘤再治療后更容易復發(fā)，再復發(fā)后的腫瘤治療后的復發(fā)可能性比原發(fā)腫瘤高3倍。多種因素可導致臨床RFA治療肝臟惡性腫瘤時的消融范圍有限［8－9］，故為了確保最大化抑制腫瘤增殖，防止腫瘤細胞復發(fā)，應盡量一次即對腫瘤做出較徹底的消融，研究［10－11］顯示燒灼邊緣＜1 cm是影響肝內(nèi)遠處復發(fā)的獨立危險因素，故RFA的“安全邊界”應超出腫瘤邊緣1 cm，以破壞腫瘤細胞的骨架、影響腫瘤細胞生物膜的各種功能和狀態(tài)，最終使腫瘤細胞凋亡和壞死率最大化，達到預防腫瘤復發(fā)的目的。

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Effect of radiofrequency ablation on PCNA mRNA and VEGF expression in rabbit liver VX2tumor models

Tang Wenjing，Lv Weifu，Wang Yaguang，et al
（Dept of Medical Imaging，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

ObjectivTo study the expression of proliferating cell nuclear antigen（PCNA）mRNA and vascular endothelial growth factor（VEGF）of different zones after radiofrequency ablation（RFA）was performed on rabbit liver VX2 tumor models，in order to observe RFA＇s effect on cells’apoptosis and proliferation.MethodsThe tumor models were divided into two groups.One was radiofrequency ablation（RFA）group，which consisted of 42 rabbits liver VX2tumor models.The other was the control group，which consisted of 6 rabbits liver VX2tumor models.All the models were observed immediately，1 d，2 d，1 w，2 w，3 w separately after RFA.By HE staining，Annexin V-FITC／PI mark，PCNA mRNA and VEGF tests，we observed the apoptosis and proliferation of the cells in different periods and different zones after RFA.ResultsIn the control group，tumor showed infiltrative growth.In the RFA group，after RFA，large areas of necrosis were found in the central ablation zone，while inflammatory cells and residual tumor cells were found in the boundary zone.After RFA，a large number of necrotic cells were found in the target areas immediately，especially in the needle tract zone，and the necrosis rate was about（45.16 ±4.44）%；necrosis rate in the needle tract zone 3 weeks after RFA was still significantly higher than thermal coagulation zone and the boundary zone（F＝142.089，P＝0.000）.Simultaneously，3 week after RFA，apoptosis rate of tumor cells in every zone was significantly decreased，approaching pre-RFA levels；the PCNA mRNA expression level of needle tract zone remained low 1 d after RFA，and the PCNA mRNA expression level of thermal coagulation zone 3 weeks after RFA returned to the level of pre-RFA（P＝0.159），and PCNA mRNA expression level of the boundary zone 2 week after RFA was significantly higher compared to that 1 week after RFA（P＝0.000）.But still lower than the control group pre-RFA（P＝0.001）.But 3 weeks after RFA，PCNA mRNA expression level was higher than the control group pre-RFA in the boundary zone（P＝0.031）；VEGF expression of boundary zone of RFA group was significantly higher than the needle tract zone and thermal coagulation zone（P＜0.05）.ConclusionCells in needle tract zone after RFA can be completely killed，but for the residual of border zone，RFA may contribute to the recurrence and metastasis，which still need further treatment.

radiofrequency ablation；VX2tumor；cell apoptosis；cell proliferation；PCNA；VEGF

R 8

A

1000－1492（2014）11－1558－04

2014－05－19 接收

安徽省教育廳自然基金重點項目（編號：KJ2008A33ZC）

安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院介入科，合肥 230001

唐文靜，女，碩士研究生；

呂維富，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：lwf99＠126.com