屠姍姍，夏 榮，吳先友

純鈦表面激光熔覆處理的進一步實驗研究

屠姍姍1，夏 榮1，吳先友2

目的探討激光熔覆后鈦表面多孔形貌對細胞黏附、增殖和分化的影響。方法在氬氣保護環(huán)境中應用脈沖式摻釹釔鋁石榴石晶體（Nd：YAG）對45 μm鈦粉顆粒在鈦片表面進行激光熔覆，采用場發(fā)射掃描電鏡（SEM）觀察鈦片表面微觀形貌，能量彌散X射線譜（EDS）檢測鈦片表面成分；采用小鼠骨髓基質干細胞BMSCs體外培養(yǎng)評價噴砂酸蝕組（A組）和激光熔覆組（B組）的生物相容性。SEM觀察BMSCs在鈦表面的黏附狀況，細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測法和堿性磷酸酶（AKP）活性檢測評價鈦片對BMSCs增殖和分化的影響。結果與A組比較，B組互相連通的多孔鈦表面更有利于BMSCs的黏附，也有利于BMSCs細胞的增殖和分化。結論激光熔覆處理鈦片表面可促進BMSCs黏附、增殖及分化，有望成為一種有效有前景的鈦表面處理方法。

純鈦；激光熔覆；骨髓基質干細胞；表面處理

種植體成功在很大程度上取決于植入后最初材料的機械穩(wěn)定性，以及隨后其與骨組織間強大的活性界面。鈦是目前最常見的種植體材料，擁有足夠的機械強度，滿足材料的穩(wěn)定性，且給骨組織生長提供臨時的支撐，另一方面其具有良好的人體生物相容性，可與骨組織形成牢固的骨結合。種植牙是一種以植入骨組織內的下部結構為基礎來支持、固定上部牙修復體的缺牙修復方式，其安全性高、損傷小，應用廣泛。為了提高種植的成功率，各種表面處理研究越來越多。表面處理是指用機械和化學等方法使種植體表面疏松、粗糙化，從而具有更好的生物黏附力和骨組織親和性，加快骨結合。相對于傳統(tǒng)表面處理方式，激光熔覆具有機械化的精確、高效等優(yōu)點，其為加法制作原理，較減法制作節(jié)省材料，已涉及人體內研究［1］。該研究利用激光熔覆技術構建鈦片表面微納米級多孔形貌，與傳統(tǒng)酸蝕噴砂技術進行比較，探討鈦表面多孔形貌對小鼠骨髓基質干細胞（bone marrow stem cells，BMSCs）黏附、增殖和分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料和試劑 45 μm鈦粉（純度達為99.9%），直徑為10 mm、厚度為2 mm的純鈦片由陜西省寶雞銳誠鈦業(yè)有限公司提供；400 μm大顆粒氧化鋁粉由廣州莫秦有限公司提供；小鼠骨髓基質干細胞、胎牛血清、細胞培養(yǎng)液由上海創(chuàng)始實業(yè)有限公司提供；細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）由上海BestBio公司提供；堿性磷酸酶（AKP）檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.2 主要儀器和設備 中國科學院安徽光學精密機械研究所提供Nd：YAG脈沖激光器；中國科學院材料物理重點實驗室提供場發(fā)射掃描電鏡（美國FEI公司sirion 200）；安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院實驗室提供CO2培養(yǎng)箱（德國heraeus）、倒置顯微鏡（OLYMPUS CKX41）、酶標儀（美國BioTek公司，ELx800）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 1000＃砂紙將直徑為10 mm、厚度為2 mm的鈦片表面拋光，依次用丙酮、無水乙醇、超純水超聲分別清洗30 min，45℃烤箱中烘干。

A組：噴砂酸蝕組，垂直光滑鈦片表面用400 μm大顆粒氧化鋁噴砂10 s，清洗后置于67%HCl／H2SO4（1∶1）中，在80℃下酸蝕10 min，再置于蒸餾水防氧化。

B組：激光熔覆組，選擇九水硅酸鈉做為粘結劑，將45 μm鈦粉均勻涂于干燥的鈦片上烘干，選擇電流110 A，峰值功率2.2 KW對上述預涂層鈦片進行激光熔覆處理。將兩組鈦片依次用丙酮、無水乙醇、超純水超聲分別清洗30 min，烘干。

1.2.2 表面形態(tài)和成分 場發(fā)射掃描電鏡（sacnning electron microscopy，SEM）觀察鈦片表面微觀結構，能量彌散X射線譜（energy dispersion spectros-

copy，EDS）檢測表面成分。

1.2.3 細胞黏附觀察 將兩組鈦片采用高壓蒸汽（200℃）滅菌后置于24孔培養(yǎng)板中，用胰酶消化第8代小鼠BMSCs，配制細胞懸液，以每孔4×104個細胞接種至24孔培養(yǎng)板，倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況。每組9個鈦片，于24、48、72 h各取出3個，2.5%戊二醛固定2 h，PBS反復沖洗，自然風干，噴金，SEM觀察鈦片表面細胞黏附、生長情況。

1.2.4 細胞增殖檢測 同1.2.3法接種細胞培養(yǎng)。每組16個鈦片，第1、3、5、7天時每組取出4個，置入24孔培養(yǎng)板，每孔加入CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中孵育4 h，酶標儀在450 nm波長下檢測吸光度（OD）值。

1.2.5 細胞分化檢測 同1.2.3法接種細胞培養(yǎng)。每組12個鈦片，第3、5、7天時每組取出4個，置入24孔培養(yǎng)板，每孔加入0.1%的Triton X-100，培養(yǎng)箱中孵育1 h，滴加AKP檢測試劑，37℃恒溫水浴15 min后加入顯色劑，酶標儀在450 nm波長下檢測吸光度（OD）值。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 15.0軟件進行分析，統(tǒng)計學方法采用單因素方差分析，檢驗水準α＝0.05。

2 結果

2.1 鈦表面觀察電鏡查看鈦表面形態(tài)，A組表面孔徑大小為0.5～3 μm，B組表面相互連通的三維孔洞直徑大小為100 nm～20 μm。見圖1。

2.2 表面成分分析EDS分析鈦表面成分，兩組表面除主要成分為鈦外，A組還含有噴金后存在的金（Au）元素，B組含少量硅和碳元素。見圖2。

圖1 兩組鈦表面形貌 SEM×5 000

圖2 兩組鈦表面能譜

2.3 細胞黏附觀察BMSCs生長24、72 h噴金后鈦片表面電鏡形貌，A組：粗糙表面細胞沿表面淺窩生長；B組：細胞沿表面孔洞生長，三維孔洞內出現(xiàn)纖維蛋白網(wǎng)狀結構。見圖3、4。圖4 B1、B2中箭頭所示可見纖維網(wǎng)狀結構。

圖3 BMSCs生長24 h后鈦片表面電鏡

圖4 BMSCs生長72 h后鈦片表面電鏡

2.4 細胞增殖檢測與A組比較，B組在第5、7天時OD值升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖5。

圖5 兩組鈦片細胞培養(yǎng)1、3、5、7 d時細胞增殖曲線

2.5 細胞分化檢測與A組比較，B組在第5、7天時OD值升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖6。

3 討論

牙種植體，最終的目標是獲得種植體和天然周圍骨之間的固定、結合和穩(wěn)定，此過程源自自身間充質干細胞可以遷移到植入部位，增殖并分化為成熟的成骨細胞，并分泌胞外基質形成骨結合。此過程與種植體表面形態(tài)有一定關系，諸多研究［2－3］顯示，機械光滑鈦表面細胞為平層結構，主要為二維形態(tài)，而粗糙鈦表面細胞為多邊形態(tài)，三維形態(tài)的粗糙表面有更大的接觸面積，促進細胞黏附、增殖、擴散和分化，從而能促進成骨細胞合成骨組織。

圖6 兩組鈦片細胞培養(yǎng)3、5、7 d時細胞分化能力曲線

牙種植體成功與種植材料表面積大小直接相關，因此為了提高種植體成功率，增加骨結合率，產(chǎn)生了多種多樣的表面處理方式。經(jīng)典的處理方法是噴砂酸蝕，可構造蜂窩狀結構的粗糙表面，瑞士Stratmmnn公司推出的ITI牙種植體系統(tǒng)即是噴砂酸蝕表面處理，粗糙表面微孔直徑約2 μm，噴砂酸蝕種植體有可能存在殘余噴砂顆粒，對種植體有一定影響，另一方面鈦表面在噴砂過程中或噴砂酸蝕表面暴露于空氣中大于24 h，易被碳氫化合物污染，碳氫化合物封鎖了種植體表面活性羥基，降低了表面親水性，是影響鈦生物活性的一個因素，親水改性的粗糙鈦表面促進牙種植體周圍骨結合［4－5］。本實驗中，將噴砂酸蝕處理的鈦片保存在蒸餾水中可以防止噴砂酸蝕表面進一步被污染［6］，而激光熔覆處理的鈦表面則穩(wěn)定性好，無需特殊保存。

瑞士ITI牙種植體與市場上銷售的巴西表面雙酸蝕刻種植體［7］構造蜂窩狀結構的粗糙表面有利于骨結合形成，而本實驗鈦表面激光熔覆處理也構造出相互連通的粗糙表面，三維孔洞直徑大小為100 nm～20 μm，直接設定各項激光參數(shù)還可調控三維孔洞直徑大小范圍，且不會形成表面雜質［8］。

激光熔覆技術利用高能密度的激光束在原料粉末和金屬表面快速形成熔池又快速凝固，此過程增加了涂層與基體之間的結合強度，通過激光熔覆技術對鈦表面進行改性，可以改善鈦表面的性能并增強其生物活性。激光快速成形技術將激光熔覆技術和快速成形技術結合起來，在很多領域，特別是口腔醫(yī)學領域將得到廣泛的應用。其原理是將計算機輔助設計的三維模型轉換為按一定厚度分層的二維輪

廓信息，再利用激光熔覆方法將金屬粉末逐層堆積，最終得到三維實體成品。

激光熔覆處理形成的微觀鈦表面為相互連通的開放多孔結構，相對于酸蝕表面，可以為成骨細胞附著提供更積極的誘導作用。鈦表面增加了表面粗糙度，可能有助于集中更多的蛋白質［9］，從而提高黏接強度；鈦表面的多孔結構呈開放性，有利于引導成骨細胞向內生長和附著，也容易引導血管長入，形成血管網(wǎng)又可為細胞提供更多營養(yǎng)；鈦表面的多孔結構相互連通，不僅增加了表面接觸面積及后期成骨的機械鎖結力，還起到橋梁的作用，促進細胞定位和體液傳輸；鈦表面孔洞結構還易形成交錯的纖維蛋白網(wǎng)，纖維蛋白網(wǎng)可為細胞生長提供更多的引導和支撐，從而加快加強骨結合［10］。而酸蝕噴砂形成的孔洞非相互連通，孔洞深度有限。

牙種植體骨結合成功后還得承擔咀嚼力的傳導，激光熔覆產(chǎn)生的互連開放的多孔結構有助于減少植入體表面的密度，從而減少應力集中，實現(xiàn)長期協(xié)調穩(wěn)定［11］，該設計從機械的角度來看，孔隙率和孔的幾何形狀影響支架的機械性能和應力疲勞，表面結構的彈性模量，應該是既有足夠的強度，以維持生理負荷，又不應超過材料的剛度，防植入體的折裂。

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Study of titanium surface modified by laser cladding

Tu Shanshan1，Xia Rong1，Wu Xianyou2
（1Dept of Stomatology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601；2Center of Medical Physics and Technology，Hefei Institutes of Physical Science，Chinese Academy of Sciences，Hefei 230031）

ObjectivThis work focuses on the titanium surface with porous structure obtained by laser cladding and evaluation of cell adhesion，proliferation and differentiation.MethodsThe specimens were prepared by a pulsed Nd：YAG laser cladding of titanium powder with a particle size of 45 μm on it in an argon atmosphere.The microstructure and chemical composition analyses were performed by sacnning electron microscopy（SEM）and energy dispersion spectroscopy（EDS）.SEM，CCK-8 method and alkaline phosphatase activity assay were taken to evaluate the effect of the adhesion，proliferation and differentiation of mice bone marrow stem cells.ResultsThe titanium surface microstructure of multilevel and interconnected holes was proved of good cell biocompatibility.ConclusionLaser cladding proves to be an efficient means of surface modification of dental implants and the modified surface has a significant effect on the adhesion，proliferation and differentiation of BMSCs.

pure titanium；laser cladding；bone marrow stem cells；surface modification

R 783.1；TN 249；R 329.24

A

1000－1492（2014）11－1566－04

2014－06－27 接收

安徽省教育廳自然科學研究項目（編號：KJ2009A037Z）；安徽省科技廳年度重點科研項目（編號：12070403070）；安徽省學術和技術帶頭人科研活動經(jīng)費資助（編號：2014H030）

1安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院口腔科，合肥 230601

2中國科學院醫(yī)學物理與技術中心，合肥 230031

屠姍姍，女，碩士研究生；

夏 榮，男，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：xiarongqh＠aliyun.com