梅 美，李曉蕾，張 寧

·技術與方法·

口腔全菌生物膜對新型抗菌性復合樹脂表面粗糙度的影響

梅 美，李曉蕾，張 寧

目的體外培養(yǎng)口腔菌斑生物膜，研究口腔全菌生物膜對含有甲基丙烯酸十二烷基二甲銨（dimethylaminododecylmethacrylate，DMADDM）的抗菌復合樹脂材料表面粗糙度的影響，從而評價材料的性能及其臨床應用前景。方法合成DMADDM并將其添加入復合樹脂中，將含有和不含有DMADDM的復合樹脂作為實驗組和對照組，使用人唾液培養(yǎng)所得到牙菌斑全菌生物膜模型來研究生物膜，檢測菌落形成單位（colony forming unit，CFU）計數及生物膜活／死細菌染色，并檢測口腔全菌生物膜培養(yǎng)7 d前后實驗組和對照組材料表面粗糙度的差異。結果添加DMADDM的實驗組復合樹脂顯著降低了CFU計數（P＜0.01），與對照組比較，實驗組的3個CFU計數均降低了3個數量級。菌斑生物膜培養(yǎng)7 d后，實驗組復合樹脂表面粗糙度沒有明顯變化（P＞0.05），而對照組復合樹脂表面粗糙度明顯增加（P＜0.01）。結論含有DMADDM的復合樹脂材料具有很強的抗菌性，能夠抵抗口腔環(huán)境對材料表面老化粗糙的影響，具有一定的臨床應用前景。

復合樹脂；菌斑生物膜；抗菌性能；表面粗糙度

復合樹脂因具有優(yōu)良的美學效果，以及簡便的臨床操作過程等優(yōu)勢，近年來被廣泛應用于修復牙體缺損和改善牙齒外觀［1］。但研究表明，較其他口腔修復材料，復合樹脂更容易在表面堆積菌斑生物膜［2］。菌斑生物膜是引起繼發(fā)齲和修復失敗的主要原因［3］，一方面會直接引起某些口腔軟硬組織感染性疾病如繼發(fā)齲、義齒性口炎；另一方面則能造成材料的老化粗糙，導致材料性能下降，從而更易吸引細菌黏附［4］。這樣的惡性循環(huán)最終將會造成修復失敗，甚至對全身產生不良影響。因此，研究抗菌復合樹脂，抑制菌斑生物膜生長和繼發(fā)齲發(fā)生至關重要。季銨鹽類的單體，如甲基丙烯酸十二烷基二甲銨（dimethylaminododecyl methacrylate，DMADDM），可以共聚合到樹脂基之中，使其產生抗菌活性，且不損害樹脂的機械性能［5］?？删酆霞句@鹽是一種有效的抗菌單體，它的分子結構中同時具有能與樹脂單體發(fā)生反應的可聚合基團和抗菌功能基團，單體通過聚合反應牢牢固定于樹脂基質上，在固化后抗菌活性成分不釋放，發(fā)揮持久、穩(wěn)定的接觸抗菌功能［6］。本研究在體外培養(yǎng)口腔菌斑生物膜，研究口腔全菌生物膜對含有DMADDM的抗菌復合樹脂材料表面粗糙度的影響，從而評價材料的性能及其臨床應用前景。

1 材料與方法

1.1 含有DMADDM的抗菌復合樹脂的制備

DMADDM烷基鏈長為12個碳。使用改良門舒特金法（Menschutkin）制備DMADDM，由叔胺基與有機鹵化物發(fā)生反應［5］。將2-溴乙基甲基丙烯酸酯（2-bromo ethylmethacrylate，BEMA）作為有機鹵化物，1-二甲氨基十二烷（1-dimethylamino dedecane，DMAD）作為叔胺。將10mmol的DMAD（日本，Tokyo Chemical Industry公司），10 mmol的BEMA（美國，Monomer-Polymer and Dajac Labs），以及3 g乙醇加入20 mL的試劑瓶中。試劑瓶封口，并在70℃中攪拌24 h。反應完全后蒸發(fā)乙醇溶劑，最終得到清澈、無色的黏性液態(tài)DMADDM。

雙酚A-甲基丙烯酸縮水甘油酯和雙甲基丙烯酸二縮三乙二醇酯（美國，Esstech公司）按照1∶1混合，并混入0.5%的光引發(fā)劑樟腦醌，從而構成樹脂基質［5］。DMADDM按1∶10混入樹脂基質中。預實驗顯示，DMADDM大于10%將影響復合樹脂的機械強度。樹脂基質與經過硅烷化處理的無機填料（美國，Caulk Dentsply公司）按3∶7混合。將含DMADDM的復合樹脂作為實驗組，將不含DMADDM的復合樹脂作為對照組。

每個試件均制作成直徑10 mm、厚2 mm的圓柱形試件，制作時兩面用賽璐珞條形成光滑壓接面。每個試件每個表面光固化1min，然后將試件浸入蒸餾水，攪拌1 h，以除去任何未固化的單體。取出試件干燥并用環(huán)氧乙烷消毒（Anprolene AN 74i，美國，Andersen公司）。每個測試，每組6個試件。

1.2 人唾液的收集和菌斑生物膜的形成 人唾液［7］的捐贈者是擁有天然牙列，無活動性齲病或牙周病的健康成年人，并在過去的3個月內沒有使用過抗生素。捐贈人24 h不刷牙，并在捐贈唾液前至少2 h禁飲食。收集捐贈者在咀嚼封口膜的過程中分泌的刺激性唾液，并置于冰上。唾液在無菌甘油中稀釋至70%，并儲存在－80℃下［8］。

唾液與McBain培養(yǎng)基溶液以1∶50混合作為人全菌生物膜的接種液。McBain培養(yǎng)基中含有黏蛋白2.5 g／L、細菌蛋白胨2.0 g／L、胰蛋白胨2.0 g／L、酵母提取物1.0 g／L、氯化鈉0.35 g／L、氯化鉀0.2 g／L、氯化鈣0.2／L、鹽酸半胱氨酸0.1 g／L、血紅素0.001 g／L、維生素K10.000 2 g／L，材料均購自美國Sigma-Aldrich公司，pH值調整為7［9］。將接種液在37℃下，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24孔培養(yǎng)板每個孔放入1個試件，各孔中加入1.5mL接種液，在37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。然后將試件轉移至新的24孔板中，用新鮮McBain培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。16 h后，將試件轉移至新的24孔板中用新鮮McBain培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，最終得到培養(yǎng)2 d的菌斑生物膜。

1.3 生物膜活／死細菌染色方法 使用前面提到的培養(yǎng)2 d的菌斑生物膜進行檢測。將圓柱形試件上的生物膜在磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate buffered saline，PBS）中輕柔漂洗3次，用活／死細菌生存力試劑盒（美國，Molecular Probes公司）進行染色。SYTO-9使活細菌染色產生綠色熒光，細胞膜受損的細菌會被碘化丙啶染色產生紅色熒光。使用螢光顯微鏡觀察染色的生物膜（TE2000-S，美國，Nikon公司）。

1.4 CFU計數 將培養(yǎng)2 d的菌斑生物膜圓柱形試件轉移到2 mL試管中，通過超聲震動收獲生物膜，再用渦旋混合震蕩儀混勻（美國，Fisher公司）。使用3種瓊脂平板培養(yǎng)測定CFU。首先，用胰蛋白大豆血瓊脂培養(yǎng)板進行全菌測定［9］。再用含有15%的蔗糖的輕型唾液鏈球菌瓊脂（mitis salivarius agar，MSA）培養(yǎng)板來進行總鏈球菌測定［10］。這是因為MSA含有結晶紫、亞碲酸鉀和臺盼藍等選擇性抑菌劑，能抑制大多數革蘭陰性桿菌和除鏈球菌外的大多數革蘭陽性菌，選擇性地使鏈球菌生長。第三，用加0.2 U／mL的桿菌肽的MSA培養(yǎng)板來測定變形鏈球菌。

1.5 表面粗糙度的測定 采用粒度越來越細的金剛砂紙和自動拋光機（日本，Buehler公司）在注水的條件下將試件的表面逐級拋光，最細到粒度4 000目。試件在拋光后直接測試表面粗糙度，然后經過7 d的菌斑生物膜培養(yǎng)（前2 d培養(yǎng)方法如前所述，以后每天更換1次培養(yǎng)液，共培養(yǎng)7 d），將試件在PBS中漂洗，并通過超聲震動徹底清除表面生物膜，然后進行表面粗糙度的測試。對每個試件的拋光面中心區(qū)進行粗糙度的測定，每個試件變換角度測試3次，取均值進行統(tǒng)計。粗糙度是衡量物體表面平滑程度的量化指標，以觸針垂直位移的微米（μm）數表示。粗糙度的測定采用粗糙度測試儀Surfcom470A（日本，Tokyo Seimitu公司），在垂直倍率5 000、運行速度為0.1 mm／s、基準長度2.5 mm、切入值（cut-off值）為0.8 mm的條件下，測定中心線平均粗糙度（Ra）值。

1.6 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 13.0軟件，計量資料用均數±標準差（±s）表示，選用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生物膜染色 生物膜活／死細菌的染色見圖1?；罴毦境删G色，死細菌染成紅色。接近或重疊的活／死細菌會顯示出橙黃色。對照組（圖1A）復合樹脂表面覆蓋有大量的活細菌。相比之下，實驗組（圖1B）復合樹脂表面的菌斑生物膜主要染成紅／橙色，結果顯示含有DMADDM的復合樹脂有強的抗菌活性。

圖1 生物膜活／死細菌染色

2.2 CFU計數 全菌、總鏈球菌和變形鏈球菌見圖2。與對照組相比，添加DMADDM的實驗組復合樹脂顯著降低了CFU計數（P＜0.01）。與對照組相比，實驗組的3個CFU計數均降低了3個數量級。

圖2 CFU計數結果

2.3 復合樹脂表面粗糙度 菌斑生物膜培養(yǎng)前后復合樹脂表面的粗糙度見圖3。結果顯示，培養(yǎng)前實驗組和對照組材料表面粗糙度差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），菌斑生物膜培養(yǎng)7 d后實驗組復合樹脂表面粗糙度變化差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而對照組復合樹脂表面粗糙度明顯增加（P＜0.01）。

圖3 菌斑生物膜培養(yǎng)7 d前后復合樹脂表面的粗糙度

3 討論

光固化復合樹脂是在20世紀60年代被引入牙科領域，該材料具有色澤美觀、強度高、黏結固位效果好、良好的可塑性以及固化后可打磨、拋光等優(yōu)點，通過配制黏度適當的混合漿體，經過特定的光照射后固化，即可用于牙齒的缺損修復，因此在牙科修復領域受到了廣泛關注［1］。研究表明，復合樹脂材料表面較其他修復材料更容易堆積菌斑和生物膜［2］。菌斑則是引發(fā)繼發(fā)齲和修復失敗的主要原因［3］。因此，如何賦予復合樹脂及其黏接系統(tǒng)抗菌性能，通過其抗菌性能減小對口腔微生態(tài)環(huán)境的影響、改善修復體的長期臨床效果、維護口腔微生態(tài)環(huán)境的健康成為國內外的研究熱點。各國研究人員在研制具有抑菌作用的樹脂和復合樹脂材料方面進行了大量的工作。Imazato等［11］合成了抗菌單體甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡啶，并表明含有甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡啶的復合樹脂可以顯著抑制細菌生長。在其他研究人員的工作中，新型抗菌樹脂中有加入甲基丙烯酰氧乙基-正十六烷基-二甲基氯化銨和西吡氯銨作為其抗菌成分［12-13］。本研究將新型季銨鹽抗菌單體DMADDM添加到復合樹脂中。以往研究表明，烷基鏈長度為12的DMADDM具有更強的抗菌性能［5，14］。DMADDM通過和細胞膜結合，季銨鹽可導致細菌破裂，進而引起細胞質外泄［12］。當帶負電荷的細菌細胞接觸帶正電荷的季胺離子時，電荷平衡受到干擾，細菌可以在其自身的滲透壓作用下破裂［12］。長的陽離子聚合物可以像針刺破氣球一樣，穿透細菌細胞破壞細胞膜［15］。本研究結果顯示，含有DMADDM的復合樹脂具有很強的抗菌性，全菌、總鏈球菌和變形鏈球菌的CFU計數與對照組相比均降低了3個數量級，該結果與以往研究一致［5，14］。

在口腔環(huán)境中，復合樹脂更容易在表面堆積菌斑生物膜。菌斑生物膜造成材料表面的老化粗糙，導致材料性能下降，而粗糙的表面更易吸引細菌黏附［4］。這樣的惡性循環(huán)最終將會造成修復失敗，甚至對全身產生不良影響。Beyth等［4］對不同品牌的光固化復合樹脂應用變形鏈球菌培養(yǎng)30 d，評價變形鏈球菌對材料表面粗糙度的影響，結果表明材料表面的粗糙度隨著培養(yǎng)時間的增加而不斷增加。其他學者也進行了類似的研究，結果均表明，菌斑生物膜會對復合樹脂表面粗糙度產生顯著的影響［16］。本研究在體外培養(yǎng)口腔菌斑生物膜，研究口腔全菌生物膜對含有DMADDM的抗菌復合樹脂材料表面粗糙度的影響，結果顯示經過7 d生物膜的培養(yǎng)后，對照組復合樹脂表面粗糙度顯著增加，與以往各研究結果一致。實驗組由于添加了具有強抗菌性的DMADDM季銨鹽單體，顯著降低了菌斑生物膜的活性，大大降低了細菌的附著，從而減少了菌斑生物膜對復合樹脂表面粗糙度的影響，經過7 d生物膜的培養(yǎng)后復合樹脂表面粗糙度沒有明顯變化。

目前，用于檢測材料的可溶性抗菌性能的方法包括應用瓊脂平板彌散法觀察抑菌環(huán)、材料浸提液對細菌懸液生長的影響及材料對浮游狀態(tài)細菌生長的影響等［7］，對具有接觸性抗菌性能的含季銨鹽抗菌單體的牙科復合樹脂及黏接系統(tǒng)并不適用。另外，采用浮游狀態(tài)細菌進行抗菌研究，同口腔實際環(huán)境中的菌斑生物膜相差甚遠，尤其在細菌形成菌斑生物膜后，基因表達和生物學行為發(fā)生顯著改變，普通的抗菌藥物很難發(fā)揮作用［7］。口腔生物膜模型可以分為單一菌種、特定的混合菌和全菌模型［7］。全菌生物膜是從口腔環(huán)境中復制出的，很大程度上保持了口腔內菌斑生物膜的復雜性和異質性［7］。牙菌斑生物膜是一種復雜的生態(tài)系統(tǒng)，約含有1 000種不同的細菌種類［16］。鏈球菌在齲病發(fā)生、發(fā)展過程中起了重要的作用?？谇绘溓蚓喾N菌群，如變形鏈球菌群、唾液鏈球菌群、輕型鏈球菌群等。研究表明，變形鏈球菌是齲齒的主要致病菌［9］。因此，體外培養(yǎng)口腔菌斑生物膜，研究抗菌材料表面對菌斑生物膜的影響，對評價材料的性能及其臨床應用前景非常重要。

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The effect of microcosm biofilm degradation on the surface roughness of novel antibacterial resin com posite

MEIMei1，LIXiaolei1，ZHANG Ning2
（1.Beijing Shi Jing Shan Hospital，Teaching Hospital of Capital Medical University in Shijingshan，Beijing 100040，China；2.Beijing Stomatological Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100050，China）

ObjectiveAdental plaquemicrocosm biofilm modelwith human saliva as inoculum was used to investigate the influence of 7-day biofilm degradation on the surface of resin composite containing dimethylaminododecylmethacrylate（DMADDM）.MethodsDMADDM was incorporated into resin composite and the dental plaque microcosm biofilm model was used to evaluate biofilm colony-forming unit（CFU）counts，live／dead staining assay and surface roughness test.ResultsIncorporating DMADDM significantly reduced the CFU（P＜0.01）.All three CFU counts in experimental group were 3 orders ofmagnitude lower than those in control group.7-day biofilm degradation had much less influence on the surface roughness of resin composite containing DMADDM.ConclusionResin composite containing DMADDM has strong antibacterial potency and could resist the oral environment degradation.The novel compositemay have wide applicability in clinic.

Resin composite；Microcosm biofilm；Antibacterial property；Surface roughness

R780.2

A

2095-3097（2014）03-0166-04

10.3969／j.issn.2095-3097.2014.03.011

2014-04-24 本文編輯：徐海琴）

100040北京，首都醫(yī)科大學石景山教學醫(yī)院北京市石景山醫(yī)院（梅 美，李曉蕾）；100050北京，首都醫(yī)科大學附屬北京口腔醫(yī)院（張 寧）

張 寧，E-mail：dentistzhang112＠163.com