何文英 姚小軍 華英杰 黃國雷 吳秀麗李小寶 韓長(zhǎng)日 宋小平,*

(1海南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,?？?71158;2蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,蘭州730000;3海南師范大學(xué),熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海口571158)

1 引言

考拉維酸(3-methyl-5-[(1S,2R,4aR,8aR)-1,2,3,4,4a,7,8,8a-octahydro-1,2,4a,5-tetramethyl-1-naphthalenyl]-(2E)-2-pentenoic acid),Kolavenic acid,簡(jiǎn)稱KA,結(jié)構(gòu)式如圖1所示)為海南藥用植物暗羅根首次分離得到的一種化合物.1研究表明,KA具有抗菌、拒食活性及多種細(xì)胞毒活性的藥理作用.2作為一種潛在可開發(fā)利用的藥物小分子,有關(guān)它影響人體內(nèi)生物大分子的結(jié)構(gòu)及其相互作用的報(bào)道卻稀有.蛋白質(zhì)是生命科學(xué)的研究對(duì)象中最重要的一種生物大分子,也是藥物的一種非常重要的運(yùn)輸載體,通過研究KA與蛋白質(zhì)的相互作用及所引起的氨基酸、構(gòu)象的變化,不僅對(duì)于揭示體內(nèi)KA藥物動(dòng)力學(xué)問題、指導(dǎo)其臨床合理用藥具有一定意義,而且對(duì)于設(shè)計(jì)考拉維酸類新藥、篩選相關(guān)藥物等都具有重要的指導(dǎo)意義.3-6

蛋白質(zhì)的特定生理活性在很大程度上由其構(gòu)象決定,這是判斷藥物小分子與生物大分子是否相互作用的一個(gè)重要指標(biāo).由于生命體中蛋白質(zhì)多數(shù)以溶液狀態(tài)存在,而光譜法是研究水溶液中蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的最常用方法,如圓二色譜法、核磁共振法、熒光光譜法、紫外光譜法、紅外光譜法等.7熒光光譜分析法能夠提供包括發(fā)射光譜、激發(fā)光譜以及熒光強(qiáng)度、熒光偏振、熒光壽命、量子產(chǎn)率等多個(gè)物理化學(xué)參數(shù),可從各個(gè)角度反映蛋白質(zhì)分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況以及發(fā)光特性.紫外光譜法可以考察在物理和化學(xué)因素的影響下,蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化.8,9本文首次利用多種光譜法結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)揭示了KA與HSA的相互作用情況,定性分析了KA對(duì)HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)、微環(huán)境及宏觀結(jié)構(gòu)的影響,并從分子水平上確定了它們之間的作用力模式及多種鍵合參數(shù).

圖1 考拉維酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of Kolavenic acid

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

F-7000熒光光度計(jì)(日本日立),RF-5301PC熒光光度計(jì)(日本島津),配套的超級(jí)恒溫槽控制實(shí)驗(yàn)所需溫度,TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司),BS124S電子天平(德國賽多利斯),PH-3S計(jì)(上海精密儀器廠),Eppendorf移液器(德國).

人血清白蛋白(HSA,0.2 g?mL-1,相對(duì)分子量66478,上海伯奧生物科技有限公司),用pH 7.40 Tris-HCl緩沖溶液配制,其儲(chǔ)備液(3.0×10-5mol?L-1)4°C保存于暗處.三羥甲基氨基甲烷(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純)-鹽酸緩沖溶液(Tris-HCl):用超純水溶解并用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.40,配制成濃度為0.05 mol?L-1的緩沖液.KA由海南師范大學(xué)熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供(白色粉末,純度>99.9%,相對(duì)分子量為304.47),儲(chǔ)備液(1.70×10-3mol?L-1),用二甲基亞砜配制.實(shí)驗(yàn)水為超純水,其他試劑均為分析純.

2.2 二維及三維熒光光譜

二維熒光光譜在RF-5301PC(Shimadzu)熒光光譜儀上進(jìn)行測(cè)定.移取一定量的HSA溶液于3 mL比色皿中,逐次加入一定量KA溶液.以285 nm為激發(fā)波長(zhǎng)(λex),激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm,掃描295-500 nm范圍內(nèi)的熒光光譜(1 cm石英池).

三維熒光光譜在F-7000(Hitachi)熒光光譜儀上進(jìn)行測(cè)定:溶液配制方法同上二維熒光光譜的測(cè)定.選擇熒光激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm(1 cm石英池),分別測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)范圍在230-325 nm,發(fā)射波長(zhǎng)(λem)在230-480 nm范圍的三維熒光光譜.

2.3 同步熒光測(cè)定

同步熒光測(cè)定在RF-5301PC(Shimadzu)熒光光譜儀上進(jìn)行,以230 nm為激發(fā)波長(zhǎng),290 nm為發(fā)射波長(zhǎng)(Δλ=60 nm),測(cè)定加入不同濃度KA后HSA-KA溶液體系的同步熒光光譜(激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm).

2.4 紫外吸收光譜

在若干10 mL比色管中,依次移取一定量的HSA和KA儲(chǔ)備液,用pH 7.40的Tris-HCl緩沖溶液定容,以相應(yīng)試劑的空白為參比,在紫外-可見分光光度計(jì)上記錄HSA-KA體系在200-350 nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜(1 cm石英池).

2.5 熒光偏振度的測(cè)定

依據(jù)如下各向異性的定義:10,11

其中,P為熒光偏振度,IVV和IVH分別為垂直偏振光激發(fā)后的垂直偏振和水平偏振的發(fā)射光強(qiáng)度,η為粘度.G為儀器校正因子,G=IHV/IHH,IHV和IHH分別為水平偏振光激發(fā)下的垂直偏振和水平偏振光的發(fā)射光強(qiáng)度.選激發(fā)與發(fā)射波的狹縫寬均為5 nm,激發(fā)波長(zhǎng)為285 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為348 nm,在RF-5301PC(Shimadzu)熒光光譜儀上進(jìn)行測(cè)定(1 cm石英池).

2.6 鍵合參數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

配制不同濃度比的HSA-KA溶液體系,選擇激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為285和348 nm,采用熒光滴定法,測(cè)定三種不同溫度(298、308和318 K)下的熒光強(qiáng)度,再依據(jù)相應(yīng)的公式計(jì)算結(jié)合常數(shù).

2.7 分子模擬

從Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得HSA的晶體結(jié)構(gòu)(編號(hào)為1 h9z),根據(jù)Amber 4.0力場(chǎng),用Kollman-all-atom電荷計(jì)算出HSA三維結(jié)構(gòu)的勢(shì)能;12再用Gasteiger-marsili軟件和tripos力場(chǎng)優(yōu)化HSA分子的幾何結(jié)構(gòu),用AutoDock 3.05程序來確定KA與HSA分子之間的相互作用模式,最后用拉馬克(LGA)遺傳算法來計(jì)算KA分子與HSA結(jié)合的可能構(gòu)象,13,14所有的計(jì)算在Silicon Graphics Ocatane 2工作站上完成.

2.8 位點(diǎn)標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)

在RF-5301PC(Shimadzu)熒光光譜儀上進(jìn)行,采用熒光滴定法,固定HSA的濃度,向KA-HSA體系分別加入一定量的競(jìng)爭(zhēng)試劑苯基丁氮酮(phenylbutazone,PB)、氟芬那酸(flufenamic acid,FA)和洋地黃毒苷(digitoxin,Dig),分別作為位點(diǎn)I、II和III位的標(biāo)記藥物.15選擇激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為285和348 nm,測(cè)定HSA-KA體系在298 K的熒光強(qiáng)度.

3 結(jié)果與討論

3.1 光譜法定性分析KA影響HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)

作為血漿中最為豐富的球狀蛋白質(zhì),血清白蛋白含有多種可配位基團(tuán),可以與生物體內(nèi)許多內(nèi)源或外源物質(zhì)相互作用,因此在藥物小分子與蛋白質(zhì)相互作用的研究中常用作模型蛋白.3,4

利用紫外光譜分析HSA的光譜特征時(shí),一般約210 nm處的峰是肽鍵的強(qiáng)吸收峰,其最大吸收峰反映了其α-螺旋結(jié)構(gòu)的信息.16圖2為HSA、KA及KAHSA體系的紫外光譜圖.可看出:KA(5.6×10-6mol?L-1)具有較強(qiáng)的紫外吸收,其最大吸收波長(zhǎng)位于223 nm左右,吸收強(qiáng)度約為2.6;HSA(5.0×10-6mol?L-1)最大吸收波長(zhǎng)位于214 nm左右,吸收強(qiáng)度約為2.3;隨KA濃度的增加,HSA-KA體系發(fā)生最大吸收峰位置紅移現(xiàn)象(214 nm?225 nm),且體系的吸收強(qiáng)度并非是KA與HSA的加和.以上結(jié)果說明:KA確實(shí)與HSA發(fā)生了相互作用,使得HSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變化.

在蛋白質(zhì)分子中,色氨酸Trp殘基的熒光強(qiáng)度最大,對(duì)微環(huán)境的變化很敏感,故常作為內(nèi)源熒光探針來研究溶液狀態(tài)下蛋白質(zhì)的構(gòu)象,而同步熒光(Δλ=60 nm)呈現(xiàn)的是Trp殘基的光譜特征.7,8圖3為采用同步熒光掃描法,固定HSA濃度,依次增大KA濃度所測(cè)得的同步熒光光譜圖,從圖中可看出:KA的存在猝滅了HSA的Trp殘基熒光,熒光強(qiáng)度從150降至106左右,其最大熒光發(fā)射峰位置基本未變,但在KA濃度較大時(shí),有較明顯的雙峰出現(xiàn)跡象.說明KA對(duì)HSA微環(huán)境有一定影響.

圖2 KA-HSA體系的紫外吸收光譜圖Fig.2 UV absorption spectra of KA-HSAsystem

圖3 KA-HSA體系的同步熒光光譜圖Fig.3 Synchronous fluorescence spectra of KA-HSAsystems

在同一測(cè)定條件下,從KA-HSA體系的二維及三維熒光光譜來研究對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響.圖4及圖5為固定HSA濃度,變化KA濃度時(shí)得到的二維及三維熒光光譜.從圖4及圖5中可見,隨KA濃度的加大,相比不加KA時(shí)的HSA(圖4中曲線a及圖5A),HSA-KA體系的熒光強(qiáng)度逐漸減小(圖4中曲線b?h及圖5B),即KA猝滅了HSA的內(nèi)源色氨酸殘基的熒光,且兩種熒光譜圖的峰型均呈現(xiàn)規(guī)則形狀,并伴隨有紅移現(xiàn)象:二維譜(圖4A)顯示最大發(fā)射波長(zhǎng)從348 nm輕微紅移至350 nm,三維譜(圖5B)則從350 nm紅移至355 nm.對(duì)譜型規(guī)則及紅移可能歸結(jié)為兩個(gè)原因:一是加入KA后,使得HSA的微環(huán)境極性增大,從而形成規(guī)則的發(fā)射光譜;再是由于KA的分子結(jié)構(gòu)中存在的羧基與雙鍵,形成的共軛體系使得雙鍵上的C原子為給電子基團(tuán),導(dǎo)致熒光光譜產(chǎn)生位移,及吸收光強(qiáng)度的增大(見圖2).17以上均說明了KA的存在對(duì)HSA的色氨酸殘基所處的微環(huán)境引起的差異,也表明了HSA分子中構(gòu)象的變化.

圖4 KA-HSA體系的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of KA-HSAsystem

圖5 HSA(A)和KA-HSA體系(B)的三維熒光光譜圖Fig.5 Three dimensional(3D)fluorescence spectra of HSA(A)and KA-HSAsystem(B)

根據(jù)熒光光譜測(cè)得的相關(guān)數(shù)據(jù),確定了KA猝滅與HSA之間的熒光猝滅機(jī)理.利用Stern-Volmer方程,將F0/F對(duì)[Q]作線性擬合圖,通過該直線的斜率可得到猝滅常數(shù)(KSV),其中,F0為游離狀態(tài)下HSA的熒光發(fā)射強(qiáng)度,F為加入KA后與HSA形成復(fù)合物后的體系熒光發(fā)射強(qiáng)度,[Q]為KA的濃度.由于熒光分子與猝滅劑之間的猝滅效率常數(shù)都遵循:Kq=KSV/τ0,τ0為沒有猝滅劑存在下熒光分子的平均壽命(對(duì)大多數(shù)的生物分子τ0大約是10-8s),各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)Kq為2.0×1010L?mol-1?s-1,如果猝滅速率常數(shù)小于這個(gè)最大值,則說明猝滅過程主要為動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)理;反之,猝滅速率常數(shù)大于這個(gè)最大值,則猝滅過程可能為靜態(tài)猝滅過程,還需通過測(cè)定體系的吸收光譜是否有變化來確定.8,11

在模擬生理?xiàng)l件(pH 7.40的Tris緩沖液)下,選取三個(gè)不同溫度(298、308及318 K)進(jìn)行熒光滴定的測(cè)定,將所得數(shù)據(jù)作KA對(duì)HSA熒光猝滅的Stern-Volmer圖及KSV值計(jì)算(圖4中的插圖及表1).可看出,在選定的濃度范圍內(nèi),猝滅曲線的斜率即猝滅常數(shù)KSV值均為104數(shù)量級(jí),猝滅速率常數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2.0×1010L?mol-1?s-1,再結(jié)合吸收光譜(圖2),表明KA對(duì)HSA的熒光猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅.猝滅常數(shù)KSV值用于計(jì)算熱力學(xué)參數(shù).

3.2 鍵合參數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)的確定

利用熒光猝滅法的有關(guān)理論及公式來確定KA與HSA作用的鍵合常數(shù)、鍵合位點(diǎn)數(shù)及作用力形式.依據(jù)Scatchard公式求得鍵合常數(shù)及鍵合位點(diǎn)數(shù),3見表1及圖6,可看出KA與HSA的鍵合常數(shù)K值都較大,且隨溫度的增大,K值呈增大趨勢(shì),而鍵合位點(diǎn)數(shù)n呈減小趨勢(shì).說明KA對(duì)HSA的鍵合作用較強(qiáng),且溫度的變化會(huì)影響鍵合常數(shù)的大小.

不同小分子與HSA結(jié)合的作用力類型不同,根據(jù)Van′tHoff定律及公式可求出反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù),進(jìn)而大致確定其作用力類型,當(dāng)溫度變化不太大時(shí),反應(yīng)的焓變可看作一個(gè)常數(shù),由lnK對(duì)1/T作圖(未列出),可求得藥物與HSA相互作用的熱力學(xué)常數(shù)(見表1).18

從表1中可看出:正的ΔS值(103.112 J?mol-1?K-1)及ΔH值(8.003 kJ?mol-1)表明KA主要以疏水作用鍵合HSA,負(fù)ΔG值則表明這種鍵合過程是自發(fā)進(jìn)行的.這也與文中后面的分子模擬的結(jié)果相一致,再次證明KA鍵合在HSA亞結(jié)構(gòu)域的疏水腔.結(jié)合熱力學(xué)計(jì)算與分子模擬的結(jié)果,可得出:KA主要以疏水作用及氫鍵鍵合HSA.

3.3 熒光偏振結(jié)果

為進(jìn)一步從分子水平上探討KA影響HSA的結(jié)構(gòu)及其鍵合情況,采用了熒光偏振法.熒光偏振法可闡明溶液狀態(tài)下生物大分子的構(gòu)象以及相應(yīng)的生物活性,通過熒光偏振或各向異性值的變化,可了解藥物與蛋白結(jié)合的一些結(jié)構(gòu)信息.10,19圖7為309與319 K兩個(gè)不同溫度的條件下,改變KA的濃度而測(cè)得的HSA的熒光偏振值,其中的插圖為改變KA的濃度而測(cè)得的HSA的粘度η值.可看出,較高溫度(319 K)的偏振值均稍高于較低溫度(309 K)的,并且隨著KA濃度比的增大(0?28.30×10-6mol?L-1),偏振值都逐漸減小,在319 K HSA的偏振值下降幅度(0.041?0.012)比309 K的大(0.027?0.0009).插圖中的粘度η值也顯示了相似的變化趨勢(shì).結(jié)果說明:一方面,較小的偏振值(均小于0.1)暗示KA與HSA結(jié)合比較松散,結(jié)合后的大分子弛豫時(shí)間短,使HSA在從螺旋到無規(guī)卷曲伸展變化時(shí),由于撓性增大,故熒光偏振就小;20另一方面,KA對(duì)HSA的偏振值表現(xiàn)為下調(diào)作用,使HSA的微粘度減小,流動(dòng)性增加,并且隨溫度的增大,微粘度下降幅度逐漸增強(qiáng),說明HSA的流動(dòng)性隨KA的濃度及溫度依賴性的增大,21也證實(shí)了KA的存在引起HSA的微結(jié)構(gòu)及二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化.

圖6 KA-HSA體系的Scatchard圖Fig.6 Scatchard plots for KA-HSAsystem

3.4 KA與HSA作用的分子模擬

采用計(jì)算機(jī)化學(xué)的分子對(duì)接技術(shù),確定KA在HSA的作用區(qū)域及位點(diǎn),進(jìn)一步從理論上證實(shí)KA與HSA的相互作用,這有利于深入認(rèn)識(shí)它在生物體系中所發(fā)揮的重要功能.HSA分子分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域,它們又分別含有A、B兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域,并以相對(duì)的槽口方式構(gòu)成圓筒狀的一疏水腔,腔內(nèi)不僅是大多小分子鍵合HSA的主要區(qū)域,也包埋了幾乎所有疏水性氨基酸殘基.22

表1 KA-HSA體系鍵合值和熱力學(xué)參數(shù)比較Table 1 Comparison of the binding values and thermodynamic functions for KA-HSAsystems

圖7 HSA(3.0 μmol?L-1)的熒光偏振值(P)隨KA濃度的變化Fig.7 Variation in the fluorescence polarization(P)of HSA(3.0 μmol?L-1)with KAconcentration

圖8為KA鍵合HSA的飄帶狀分子模擬對(duì)接圖.從圖中可看出,KA分子可以鍵合在HSA分子的疏水腔內(nèi),整個(gè)分子呈非平面結(jié)構(gòu),且很靠近HSA分子的苯丙氨酸Phe211和色氨酸Trp214,這不僅是KA與HSA的鍵合存在疏水作用的一個(gè)有力證據(jù),也表明KA能猝滅HSA的內(nèi)源熒光,這兩點(diǎn)在前面的有關(guān)熒光光譜法的測(cè)定結(jié)果中得到很好的證實(shí).另外,KA與HSA氨基酸殘基的賴氨酸Lys195位和天冬氨酸Asp451位形成三個(gè)氫鍵.計(jì)算得到相應(yīng)的吉布斯自由能ΔG值為-25.050 kJ?mol-1,與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(ΔG=-22.724 kJ?mol-1)較接近.這些結(jié)果均說明KA鍵合HSA的反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的,作用力的模式主要是疏水作用,兼有部分氫鍵作用.

圖8 KA與HSA的飄帶狀模型對(duì)接圖Fig.8 Zonal binding mode between KAand HSA

3.5 競(jìng)爭(zhēng)位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為確定KA在HSA上的結(jié)合位置,選擇對(duì)HSA具有特異結(jié)合性的三種競(jìng)爭(zhēng)試劑(苯基丁氮酮(PB)、氟芬那酸(FA)和洋地黃毒苷(Dig))分別作為位點(diǎn)I、位點(diǎn)II、位點(diǎn)III位的標(biāo)記藥物,15,23通過探針標(biāo)記藥物存在時(shí)KA與HSA的結(jié)合常數(shù)的變化來判斷其結(jié)合位置.在分別含一定濃度的以上三種競(jìng)爭(zhēng)試劑的存在條件下,用熒光滴定法測(cè)定不同KA-HSA體系的熒光強(qiáng)度,用雙倒數(shù)公式處理所得的數(shù)據(jù).24與不加競(jìng)爭(zhēng)試劑時(shí)KA-HSA體系的鍵合常數(shù)相比(2.804×104L?mol-1),發(fā)現(xiàn)鍵合常數(shù)均發(fā)生了變化(見圖9),分別為:3.542×104L?mol-1(PB),4.670×104L?mol-1(FA),3.491×104L?mol-1(Dig).其中,變化幅度最大的為FA標(biāo)記物,即說明FA與KA競(jìng)爭(zhēng)鍵合HSA的相同位點(diǎn),或者可以說KA在位點(diǎn)II位與HSA發(fā)生作用.

3.6 KA與HSA鍵合的幾種物理化學(xué)參數(shù)

將光譜法測(cè)得的有關(guān)數(shù)據(jù),用相關(guān)的分析化學(xué)公式處理.8,25,26得到離解常數(shù)、電荷密度及量子產(chǎn)率(以色氨酸在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm的熒光量子產(chǎn)率0.14為標(biāo)準(zhǔn))幾個(gè)物理化學(xué)參數(shù)值,這有助于深入揭示KA與HSA的鍵合情況及發(fā)光特性,結(jié)果列于表2.從表2中可看出,在給定的KA濃度范圍內(nèi)(約6-40 μmol?L-1,體系的離解常數(shù)pKa值呈升高趨勢(shì),但是在高濃度時(shí)又稍微降低,pKa值(Ka數(shù)量級(jí)10-8)均較小,再次說明KA與HSA有強(qiáng)的鍵合作用;對(duì)體系的電荷密度δ值,隨著KA濃度的加入有減小,而且最大的值未大于0.5,說明靜電作用并非是穩(wěn)定KAHSA體系的主要作用力,這與前面所討論的鍵合模式的結(jié)果相一致;而量子產(chǎn)率Φ值呈現(xiàn)較明顯的規(guī)律降低趨勢(shì),表明KA可以猝滅HSA的熒光強(qiáng)度,也符合文中前的熒光光譜測(cè)定結(jié)果.

圖9 位點(diǎn)標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖Fig.9 Results of site marker competitive experiments

表2 KA-HSA體系的部分物理化學(xué)參數(shù)Table 2 Some parameters of physical properties for KA-HSAsystem

4 結(jié)論

本文利用多種光譜法及分子模擬方法,首次研究了海南暗羅根活性組分考拉維酸影響人血清白蛋白的結(jié)構(gòu)特征.分子模擬及位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)確定了KA在HSA上的位點(diǎn)II鍵合.多種熒光光譜法表明KA的存在影響了HSA的微環(huán)境及二級(jí)結(jié)構(gòu);紫外光譜圖表征了KA對(duì)HSA構(gòu)象的影響.熱力學(xué)參數(shù)表明KA鍵合HSA的模式主要為疏水作用;獲得的不同溫度下的鍵合常數(shù)(104數(shù)量級(jí))說明KA與HSA有較強(qiáng)的鍵合作用.并結(jié)合KA-HSA體系的幾種物理化參數(shù),從分子水平上闡明了KA與模型蛋白的鍵合反應(yīng)及作用機(jī)制.

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