金曉蓉 孫馨 林筱潔 苗青 高瑞蘭 方桂倫

·基礎(chǔ)研究·

人參二醇對(duì)魚藤酮 MPP+誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞活性下降的作用

金曉蓉 孫馨 林筱潔 苗青 高瑞蘭 方桂倫

目的觀察人參二醇對(duì)魚藤酮、MPP+誘導(dǎo)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活性下降的影響。方法以小鼠BV2細(xì)胞為研究對(duì)象，以魚藤酮（0.03、0.1、0.3、1、3μmol/L）或MPP+（10、30、100、300、1000μmol/L）處理24h和誘導(dǎo)細(xì)胞活性下降。設(shè)陰性對(duì)照組、人參二醇對(duì)照組（100 mg/L），魚藤酮（0.1μmol/L）或MPP+（100μmol/L）損傷組，人參二醇治療組（10、25、50、75、100mg/L）。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果各濃度人參二醇對(duì)BV2細(xì)胞的活性無(wú)明顯影響。魚藤酮或MPP+處理24h可誘導(dǎo)BV2細(xì)胞活性下降，各濃度人參二醇不能逆轉(zhuǎn)魚藤酮或MPP+造成的細(xì)胞活性下降。結(jié)論人參二醇對(duì)魚藤酮或MPP+誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞活性下降無(wú)保護(hù)作用。

人參二醇 魚藤酮 MPP+ 小鼠 BV2細(xì)胞

帕金森?。╬arkinson’s disease PD）是一種常見的中老年退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前臨床主要是多巴胺（dopamine DA）替代治療，該療法不能阻止DA能神經(jīng)元繼續(xù)變性和凋亡，而且副作用大。因此很有必要從中藥中尋找安全有效的神經(jīng)元保護(hù)劑。

本課題組以往研究證實(shí)人參二醇組皂苷（panoxadiol，GPD）是人參總皂苷中的有效成分，人參二醇對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用。作者自2008年1月至2010年6月以魚藤酮、MPP+誘導(dǎo)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株BV2細(xì)胞活性下降，觀察人參二醇對(duì)魚藤酮、MPP+誘導(dǎo)BV2細(xì)胞活性下降的影響，為治療帕金森病提供安全有效的中藥新藥。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 BV2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，用含10%滅活胎牛血清（購(gòu)自杭州四季青生物技術(shù)有限公司）的高糖DMEM（購(gòu)自HyClone公司）培養(yǎng)（全培養(yǎng)液），2～3d傳代，相近代數(shù)的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑 人參二醇（由浙江省中醫(yī)院提供）；二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、魚藤酮、MPP+、胰酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 藥物處理 （1）魚藤酮處理［1，2］：細(xì)胞接種于96孔板，貼壁生長(zhǎng)24h后換液（人參二醇處理組加含人參二醇的全培養(yǎng)液，對(duì)照組換全培養(yǎng)液），然后加入含不同濃度魚藤酮（0.03、0.1、0.3、1、3μmol/L）的全培養(yǎng)液，對(duì)照組換用全培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)分12組，分別為：陰性對(duì)照組；魚藤酮（0.1μmol/L）模型組；魚藤酮 加10、25、50、75、100mg/L人參二醇；人參二醇（10、25、50、75、100mg/L）對(duì)照組。人參二醇在魚藤酮給藥前24h加藥，并在魚藤酮處理全過(guò)程持續(xù)給藥。（2）MPP+處理［1，3］：細(xì)胞接種于96孔板，貼壁生長(zhǎng)24h后換液（人參二醇處理組加含人參二醇的全培養(yǎng)液，對(duì)照組換全培養(yǎng)液），然后加入含不同濃度MPP+（10、30、100、300、1000μmol/L）的全培養(yǎng)液，對(duì)照組換用全培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)分12組，分別為：陰性對(duì)照組；MPP+（100μmol/ L）模型組；MPP+ 加10、25、50、75、100 mg/L人參二醇；人參二醇（10、25、50、75、100 mg/L）對(duì)照組。人參二醇在MPP+給藥前24h加藥，并在MPP+處理全過(guò)程持續(xù)給藥。

1.4 MTT測(cè)定細(xì)胞活性［4］藥物處理完畢后，吸棄96孔板中培養(yǎng)液，每孔加入10μlMTT（5mg/ml，配制于PBS），置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μl二甲亞砜（DMSO），振蕩10min，待結(jié)晶完全溶解后，在酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處吸光值（OD570），損傷組和藥物處理組吸光值與陰性對(duì)照組吸光值的百分比，計(jì)算存活細(xì)胞百分率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Prism 4 for windows（Graph Pad Software Inc.，USA）統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用（x±s）表示。各組間方差齊時(shí)，多組間比較采用單因素方差分析，若多組間存在顯著性差異，隨后的兩兩比較采用Dunnett’s法；各組間方差不齊時(shí)，多組間比較采用Kruskal-Wallis法（非參數(shù)單因素方差分析），若多組間存在顯著性差異，隨后的兩兩比較采用Dunns法。

2 結(jié)果

2.1 魚藤酮對(duì)BV2細(xì)胞活性的影響 MTT結(jié)果提示，魚藤酮（0.03、0.1、0.3、1、3μmol/L）孵育BV2細(xì)胞24h后，細(xì)胞的活性隨魚藤酮濃度的升高而下降（P＜0.01），經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇，采用魚藤酮0.1μmol/L處理BV2細(xì)胞24h作為損傷條件，見表1，圖1。

表1 魚藤酮對(duì)BV2細(xì)胞活性的影響（x±s）

圖1 魚藤酮對(duì)BV2細(xì)胞形態(tài)的影響

2.2 人參二醇對(duì)魚藤酮處理后BV2細(xì)胞活性的影響 與對(duì)照組比較，魚藤酮0.1μmol/L處理BV2細(xì)胞24h后，細(xì)胞活性明顯降低（P＜0.01），人參二醇不能促進(jìn)細(xì)胞增殖，也不能逆轉(zhuǎn)魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞活性下降，表2。

表2 人參二醇對(duì)魚藤酮處理后BV2細(xì)胞活性的影響（x±s）

2.3 MPP+ 對(duì)BV2細(xì)胞活性的影響 MPP+（10、30、100、300、1000μmol/L）孵育BV2細(xì)胞24h后MTT試驗(yàn)表明，細(xì)胞的活性隨MPP+濃度的升高而下降（P＜0.01），經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇，采用MPP+ 100μmol/L處理BV2細(xì)胞24h作為損傷條件，見表3，圖2。

表3 MPP+對(duì)BV2細(xì)胞活性的影響（x±s）

圖2 MPP+對(duì)BV2細(xì)胞形態(tài)的影響

2.4 人參二醇對(duì)MPP+處理后BV2細(xì)胞活性的影響 與陰性對(duì)照相比，MPP+100μmol/L處理BV2細(xì)胞24h后，細(xì)胞活性明顯降低（P＜0.01），人參二醇（10、25、50、75、100mg/L）不能促進(jìn)細(xì)胞增殖，也不能逆轉(zhuǎn)MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞MTT染色吸光度下降，見表4。

表4 人參二醇對(duì)MPP+處理后BV2細(xì)胞活性的影響

表4 人參二醇對(duì)MPP+處理后BV2細(xì)胞活性的影響

注：與陰性對(duì)照組比較*P＜ 0.01。

處理濃度nOD570細(xì)胞活性（%）陰性對(duì)照62.357±0.176100.0±7.46 MPP+對(duì)照（100μmol/L）61.776±0.117*75.34±4.95*人參二醇對(duì)照（mg/L）1062.496±0.228105.9±9.69 2562.582±0.065108.5±2.76 5062.604±0.111110.5±4.70 7562.559±0.408108.6±17.3 10062.654±0.12496.28±1.29人參二醇（mg/L）加MPP+（100μmol/L）1061.710±0.079*75.54±3.37*2561.735±0.093*73.65±4.05*5061.599±0.142*67.84±6.01*7561.682±0.133*71.34±5.63*10061.798±0.121*76.26±5.14*

3 討論

1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）是一種神經(jīng)毒素，它可以穿越血腦屏障，在單胺氧化酶B作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸拘缘?-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）后，進(jìn)入多巴胺能神經(jīng)末梢和胞體，選擇性破壞黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，致多巴胺能神經(jīng)元變性死亡。這種細(xì)胞死亡的主要方式是細(xì)胞凋亡［5］。用其制備的小鼠模型是目前最好的PD動(dòng)物模型之一。已被廣泛用于PD發(fā)病機(jī)制和治療方法的研究［6］。本課題前期研究也發(fā)現(xiàn)PD模型組黑質(zhì)致密帶存活神經(jīng)元數(shù)目和多巴胺能神經(jīng)元減少。給予一定劑量的人參二醇預(yù)處理后，存活神經(jīng)元數(shù)目增多，多巴胺能神經(jīng)元脫失現(xiàn)象減少，研究結(jié)果提示：各濃度人參二醇對(duì)BV2細(xì)胞的活性無(wú)明顯影響。MPP+處理后可誘導(dǎo)BV2細(xì)胞活性下降。且細(xì)胞活性隨MPP+濃度升高而下降。本研究結(jié)果提示，人參二醇對(duì)MPP+誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞活性下降無(wú)保護(hù)作用。

魚藤酮是魚藤屬植物的提取物，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的殺蟲劑，可殺滅多種植物害蟲。Betarbet R等［7］在2000年中首次使用魚藤酮成功地誘導(dǎo)PD大鼠模型，其制作的模型受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。作為一種細(xì)胞毒性化合物，魚藤酮主要生化效應(yīng)是抑制細(xì)胞呼吸鏈對(duì)氧的利用，造成內(nèi)呼吸抑制。魚藤酮對(duì)線粒體復(fù)合物1有較強(qiáng)的親和力，可選擇性阻斷鐵-硫簇與泛醌Q的作用，終止線粒體呼吸鏈的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。造成氧化應(yīng)激及ATP生成障礙，線粒體膜通透性增加，大量釋放凋亡刺激因子和凋亡誘導(dǎo)因子，激活Caspases酶系，引起細(xì)胞凋亡［8］。由于魚藤酮能產(chǎn)生與PD流行病學(xué)和病理特征更為相似的表現(xiàn)，因而可能在機(jī)制上更接近與人類PD的自然病程［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，魚藤酮處理后可誘導(dǎo)BV2細(xì)胞活性下降且活性隨魚藤酮濃度的升高而下降。而人參二醇不能促進(jìn)細(xì)胞增殖，不能逆轉(zhuǎn)魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞活性。

綜上所述，人參二醇對(duì)MPP+或魚藤酮誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞活性下降無(wú)保護(hù)作用。

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ObjectiveTo evaluate the effects of panoxadiol on the decreased cytoactive in BV2cells（a cell line derived from microglia of the mice） induced by Rotenone or MPP+.MethodsTreated with Rotenone（0.03、0.1、0.3、1、3μmol/L）or MPP+（10、30、100、300、1000μmol/L）for 24h to induce the decreased cytoactive in BV2 cells..They were divided into a negative control group，panoxadiol（100 mg/L）control group，Rotenone（0.1μmol/L）or MPP+（100μmol/L） injury group，and panoxadiol（10、25、50、75、100mg/L treatment group respectively. Cytoactive was detected by MTT method.ResultsPanoxadiol（10、25、50、75、100mg/L）per se had no affects on the cytoactive of BV2 cells. Treatment of Rotenone or MPP+ for 24h may result in the decreased cytoactive in BV2cells，panoxadiol（10、25、50、75、100 mg/L）failed to improve the decreased cytoactive in BV2cells induced by Rotenone or MPP+.ConclusionsPanoxadiol had no protection effects on the decreased cytoactive in BV2cells induced by Rotenone or MPP+.

Panoxadiol Rotenone or MPP+ Mice BV2cell

浙江省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技研究項(xiàng)目基金（2008CA115）

322000 浙江省義烏市中心醫(yī)院內(nèi)科（金曉蓉 方桂倫）310006 浙江省中醫(yī)院血液病研究所（孫馨 林筱潔 苗青 高瑞蘭）