董雪敏，叢培云*（威海市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，山東威海264209）

威海近海?？缴愷B(yǎng)菌的分離和多樣性分析

董雪敏，叢培云*
（威海市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，山東威海264209）

對綠?？墓哺缴愷B(yǎng)菌群進(jìn)行研究。從?？谋砻婧蛣驖{液中分離到60株異養(yǎng)菌株，采用16S rRNA基因序列分析和部分生理生化試驗，確定其中56株菌的種屬情況。另外，對該類菌株所產(chǎn)胞外酶的情況以及與弧菌的拮抗情況進(jìn)行測定。結(jié)果表明：這些可培養(yǎng)菌株的群落結(jié)構(gòu)多樣性較為豐富，其中的16株菌為假交替單胞菌屬及其相關(guān)類群；其他菌株主要分布在其他19個屬中。其中，17株菌可產(chǎn)胞外蛋白水解酶；20株菌可產(chǎn)胞外脂肪酶；菌株NQ8對一些弧菌具有較強(qiáng)的拮抗作用。

綠?？?；細(xì)菌多樣性；16S rRNA基因；系統(tǒng)發(fā)育；鑒定

共附生細(xì)菌可能在清除宿主代謝廢物[1]和為宿主提供生物活性物質(zhì)[2-3]等方面扮演著重要角色。細(xì)菌-宿主關(guān)系生物學(xué)使得許多研究者對于研究共附生海洋微生物作為天然生物制品的來源產(chǎn)生相當(dāng)大的興趣[4]。海綿共附生菌產(chǎn)生的很多抗菌物質(zhì)已經(jīng)被分離到了，這說明共附生菌對宿主可能具有保護(hù)作用。一些情況下，細(xì)菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)也被證明是與其宿主有關(guān)的。

因為海洋共附生微生物的重要價值，國內(nèi)外學(xué)者開展了不少相關(guān)研究，但還處于初級階段。國內(nèi)關(guān)于海葵共附生細(xì)菌的研究報告很少，YANG B L等[5-6]都在海葵中發(fā)現(xiàn)了具有抗菌活性的細(xì)菌。謝新強(qiáng)等[7]指出從海葵、貽貝等分離到的活性菌株數(shù)高于其他動物。國外關(guān)于海葵共附生微生物的研究主要集中于共生藻類，共附生細(xì)菌未見報道。本研究采用16S rRNA基因序列分析來調(diào)查威海近海?？哺缴膳囵B(yǎng)細(xì)菌的生物多樣性，并對這些菌株產(chǎn)生胞外酶和拮抗物質(zhì)的情況進(jìn)行初步分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品采集：實驗所用?？鸄nthopleura midori（刺胞動物門，珊瑚蟲綱，海葵目，綠海葵）于2008年4月份從威海近海（中國山東，緯度37.533 1°N；經(jīng)度122.061 9°E）潮間帶采集。采集的海葵保存至裝有海水的標(biāo)本袋中，密封，防止?？c空氣直接接觸并迅速帶回實驗室，并于超凈工作臺中及時處理。

2216培養(yǎng)基（海生細(xì)菌的增菌培養(yǎng)）：青島海博生物技術(shù)有限公司；PCR試劑盒：日本東洋紡株式會社上海子公司；吐溫80、胰蛋白酶和大豆瓊脂培養(yǎng)基等試劑由實驗室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3750型高壓滅菌鍋：日本SANYO公司；BPX-162型恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅公司；高速冷凍離心機(jī)、LS-D202型金屬?。好绹鳷hermo公司；Tanon-3500凝膠成像儀：上海天能科技有限公司；超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PTC-200型PCR儀：美國伯樂公司；DYY-6c型DNA電泳儀：北京六一儀器廠；HH-1型水浴鍋：常州國華電器有限公司；HQ-60漩渦混合器：北京同正生物技術(shù)發(fā)展公司；DELTA 320pH計：梅特勒-特立多儀器有限公司；IS-RDS3型恒溫振蕩器：美國精騏有限公司；DW-86L-626型超低溫冰箱：青島海爾集團(tuán)；SIGMA1-14型常溫離心機(jī)：德國森馬公司；JY92-II型超聲波粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；Gene Quant 100紫外分光光度計：美國GE公司。

1.3 方法

1.3.1 ?？哺缴愷B(yǎng)細(xì)菌的分離

對?？M(jìn)行無菌處理，即稱質(zhì)量后用無菌海水反復(fù)清洗。將海葵表面直接在培養(yǎng)基上涂布以獲得其表面的細(xì)菌，暫時以BM、HK和JS標(biāo)記。解剖?？玫? cm2體腔壁，用無菌海水沖洗?？w腔（洗去體腔內(nèi)的顆粒物質(zhì)），將其研磨成漿，用無菌海水按照10-1～10-6的比例進(jìn)行梯度稀釋，以NQ標(biāo)記。在2216E固體培養(yǎng)基上涂布均勻，28℃下培養(yǎng)至菌株長出。

1.3.2 PCR測序和系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株轉(zhuǎn)接入分離培養(yǎng)基中于恒定光源的恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)過夜。取一環(huán)單菌落懸浮于50 μL無菌去離子水中，100℃水浴加熱5 min，離心，取上清液作為PCR模板DNA。擴(kuò)增正向引物27F對應(yīng)于E.coli16S rDNA序列的第8～27個堿基位置，反向引物1492R對應(yīng)于E.coli 16SrDNA的第1 492～1 510個堿基位置，其序列分別為5′-AGAGTTTGATC（C/A）TGGCTCAG-3′和5′-TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT-3′。100 μL PCR反應(yīng)體系組成為：1×PCR緩沖液，1.5 mmol/L MgC12，4×dNTP混合物各200 μmol/L，引物各0.5 μmol/L，TaqDNA聚合酶1 μL（5 U/μL），2 μL DNA原液。PCR反應(yīng)條件為：96℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，50℃復(fù)性1 min，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；最后72℃溫育7 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，直接交由上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行純化和序列測定。所有的16S rRNA基因序列長度在1000bp左右，已提交到GenBank并獲得GenBank收錄號。運用Blast程序與數(shù)據(jù)庫中已存在的細(xì)菌16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性比較分析；序列的比對及系統(tǒng)發(fā)育分析采用MEGA（4.0）軟件。

1.3.3 生理生化特性

（1）鹽度耐受性試驗

細(xì)菌分別培養(yǎng)在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、1%、3%、5%、7%、9%和11%的胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）培養(yǎng)基上。在28℃培養(yǎng)5 d后，以形成菌落的情況指示該菌的耐鹽性。

（2）胞外蛋白酶的測定

胞外蛋白酶的試驗可以顯示菌株是否生產(chǎn)這類酶，并能初步顯示其產(chǎn)酶能力。將脫脂牛奶以終體積分?jǐn)?shù)5%加入滅菌的2216E培養(yǎng)基中。接種后，在28℃培養(yǎng)5 d，通過菌落周圍形成的由于蛋白質(zhì)顆粒被水解而清晰可見的透明環(huán)來判斷菌株是否產(chǎn)胞外蛋白酶，透明環(huán)的直徑反映其產(chǎn)酶能力。

（3）胞外脂肪酶的測定

吐溫是含有不同鏈長的水溶性飽和脂肪酸溶液。10%的吐溫80單獨滅菌，然后以終體積分?jǐn)?shù)1%加入滅菌的2216E培養(yǎng)基中，添加0.01%（w/v）CaCl2·2H2O。接種后，在25℃培養(yǎng)7 d，通過菌落周圍形成的明顯晶體（由于吐溫被水解而形成的不溶性鈣鹽）判斷菌株是否產(chǎn)脂酶。

（4）拮抗菌的篩選

利用瓊脂擴(kuò)散法和雙層瓊脂法[8]來測定菌株的抗菌活性。接種后，在28℃培養(yǎng)48 h，通過菌落周圍因指示菌無法生長而留下的透明圈來確定該菌株產(chǎn)生了抗菌物質(zhì)。測量菌落的直徑（Dc）和抑菌圈的直徑（Di），用Di/Dc的比值來確定抗菌能力的大小。供試菌有：E.coli，Staphylococcus aureus，Vibrio anguillarum，Vibrio aestuarianus，Vibrio alginolyticus，Vibrio campbellii，Vibrio carchariae，Vibrio cincinnatiensisi，Vibrio costiola，Vibrio damsela，Vibrio diazotrophicus，Vibrio fisheri，Vibrio fluvialis，Vibrio furnissi，Vibrio gazogenes，Vibrio harveyi，Vibrio vulnificus，Vibrio mediterranei，Vibriomimicus，Vibrionatriegens，Vibrionereis，Vibrio orientalis，Vibrio parahaemolyticus，Vibrio pelagia，Vibrioproteolyticus，Vibriosplendidus，Vibriotubiashii，Vibrio vulnificus，Vibrio logei，Vibrio hollisae，Vibrio parahaemolyticus。

2 結(jié)果與分析

2.1 海葵共附生異養(yǎng)細(xì)菌的分離

通過以上實驗，總共分離得到60株細(xì)菌。其中，31株是從?？捏w腔壁分離到的，29株是從體表分離到的。

2.2 16S rRNA基因序列分析

測定和分析了56株菌的16S rRNA基因序列信息，另外4株菌經(jīng)形態(tài)觀察和生理生化試驗鑒定屬于Pseudoalteromonas屬，結(jié)果見表1。其中，28條基因序列來自分離自體腔壁的細(xì)菌，其余的來自海葵體表細(xì)菌。所有序列被提交給GenBank，收錄號分別是FJ211070，F(xiàn)J205736，F(xiàn)J205738，F(xiàn)J205739，F(xiàn)J205740-FJ205752，EU939692-EU939694，EU 939696-EU939715和FJ810051-FJ810055。

一般認(rèn)為，16S rDNA序列同源性＞99%，可以認(rèn)為屬于同一個種；16SrDNA序列同源性＜98%，可以認(rèn)為屬于不同的種；同源性＜95%，可以認(rèn)為屬于不同的屬[9]。16S rRNA基因序列分析表明這些菌株具有很高的多樣性，分別屬于8個目（Alteromonadales，Vibrionates，Peseudomonadales，Oceanospirillales，Rhodobacterales，Bacillales，Actinomycetales，F(xiàn)lavobacteriales），11個科（Colwelliaceae，Alteromonadaceae，Vibrionaceae，Moraxellaceae，Pseudomonadaceae，Hahellaceae，Rhodobacteraceae，Bacillaceae，Staphylococcaceae，Micrococcineae，F(xiàn)lavobacteriaseae），21個屬（Colwellia，Vibrio，Acinetobacter，Pseudomonas，Endozoicomonas，Roseovarius，Paracoccus，Loktanella，Leisingera，Sulfitobacter，Bacillus，Staphylococcus，Plantibacter，Microbacterium，Micrococcus，Joostella，Psychroserpens，Cellulophaga，Krokinobacter，Polaribacter，Psychrobacter）。

表1 56株海葵附生細(xì)菌的16S rRNA部分序列的鑒定結(jié)果Table 1 Partial sequence 16S rRNA identification results of 56 strains anemones epiphytic bacteria

續(xù)表

續(xù)表

圖1 細(xì)菌部分的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of bacterium part

依據(jù)16S rRNA基因序列分析，得到了56株菌的系統(tǒng)發(fā)育分析樹（見圖1）。

根據(jù)16S rDNA序列分析的結(jié)果，32株菌可以鑒定到種的水平，另外24株能被鑒定到屬的水平。結(jié)果顯示28.6%的菌株（16株）屬于Pseudoalteromonas和近緣的屬，其中，13株菌來自?？w表。所以Pseudoalteromonas屬的菌是海葵體表的優(yōu)勢菌種。第二大菌群是Rhodobacterales，11株菌（19.6%）經(jīng)鑒定屬于這個屬，其中9株菌是從體腔壁分離到的。這顯示Rhodobacterales屬菌是海葵體腔壁的優(yōu)勢菌。與已明確鑒定種的最大同源性＜97%的菌株可以被認(rèn)為是潛在的新種[10]，根據(jù)16S rRNA基因序列，發(fā)現(xiàn)7株菌，NQ2、NQ3、NQ10、NQ19、NQ21、BM6和HK3可能是潛在的新種。

2.3 鹽度耐受性實驗結(jié)果

經(jīng)測試，有30株菌不能在無鹽的培養(yǎng)基上生長，有16株可以在無鹽情況下生長。另外有7株菌（HK10，NQ1，NQ2，NQ15，NQ29，NQ30，NQ31）在任何鹽度測試培養(yǎng)基上都不生長，在除瓊脂外同樣配方的液態(tài)培養(yǎng)基中，也不生長。分析其原因可能是海水中復(fù)雜的離子成分對于它們的生長是必需的。大多數(shù)菌株在3%鹽度下生長狀況最好，但是有15株菌例外。菌株BM2，BM5，HK1，HK3，HK7，HK12，NQ5最適鹽度分別在5%～7%；而菌株HK8，HK9，JS2，JS11，JS12，NQ2，NQ3，NQ20，NQ22的最適鹽度在0～2%。

2.4 胞外酶類的測定

經(jīng)測定，17株菌產(chǎn)胞外蛋白酶，20株菌能夠產(chǎn)生胞外脂肪酶，結(jié)果見表2。其中，6株菌（NQ4，NQ5，NQ6，NQ8，NQ14，JS2）產(chǎn)酶能力較高，它們的Dt/Dc比值超過4。這6株菌中，其中5株來自?？w腔壁，這些菌株可能有助于幫助寄主消化食物中的蛋白。

表2 胞外酶測試結(jié)果Table 2 Determination result of extracellular enzyme

2.5 拮抗菌的篩選

經(jīng)篩選，菌株NQ8對許多供試菌有明顯的拮抗作用。試驗結(jié)果表明NQ8對Vibrio aestuarianus（Dt/Dc=11.01），Vibrio anguillarum（10.95）和Vibrio harveyi（10.05）有較強(qiáng)的拮抗作用。另外，NQ8也拮抗E.coli（3.00），Staphylococcus aureus（4.30），Vibrio gazogelles（4.09）和Vibrio parahaemolyticus（7.88）。弧菌屬細(xì)菌能夠引起許多水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的病害，使水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)蒙受巨大損失，因此弧菌拮抗菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)有著巨大的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

本實驗結(jié)束后，從威海近海?？缴⑸镏蝎@得具有較大價值的許多菌株。菌株HK12很可能是Polaribacter屬的新種，它與已明確鑒定的Polaribacter franzmannii有最高同源性（96.82%）。Polaribacter屬建于1998年，該屬的菌種都來自海洋，并且大部分是從極地海域分離出的[11-14]。Flavobacteriaceae科包括許多海洋菌株，被稱為是系統(tǒng)發(fā)育樹上的“海洋的進(jìn)化枝”。菌株NQ5被鑒定為Vibriosp，與庫中已明確鑒定菌株的比對結(jié)果顯示NQ5與Vibrio splendidus（ATCC 33125T）同源性最高，達(dá)到96.86%。Vibrio屬是1854年建立的，該屬有30多個種，其中至少有12株是致病菌[15]。菌株HK3與Pseudoalteromonas arctica有96.52%的同源性。Pseudoalteromonas建立于1995年[16]，是Alteromonadales-Pseudoalteromonadaceae門重要的海洋菌屬。

許多生物學(xué)家認(rèn)識到共附生細(xì)菌是有價值的生物資源。他們研究過海綿、海參、魚類、蝦類等的共附生細(xì)菌[17-20]。本研究展示了海葵的價值，?？哺缴?xì)菌有很高的多樣性，并且包括許多新的菌種。當(dāng)然，其他動物甚至整個海洋都是物種資源的寶藏。

[1]WILKINSON C R.Microbial associations in sponges.I.Ecology,physiologyand microbial populationsofcoral reefsponges[J].Mar Biol,1978, 49(2):161-167.

[2]UNSON M D,HOLLAND N D,FAULKNER D J.A brominated secondary metabolite synthesized by the cyanobacterial symbiont of a marine sponge and accumulation of the crystalline metabolite in the sponge tissue[J].Mar Biol,1994,119(1):1-11.

[3]HENTSCHEL U,SCHMID M,WAGNER M,et al.Isolation and phylogenetic analysis of bacteria with antimicrobial activities from the Mediterranean spongesAplysina aerophobaandAplysina cavernicola[J]. FEMS Microbiol Ecol,2001,35(3):305-312.

[4]PIEL J.Metabolites from symbiotic bacteria[J].Nat Prod Rep,2004,21 (4):519-538.

[5]YANG B L,WANG Y Y,LI H,et al.Study on antimicrobial activity of symbiotic and epiphyte microorganisms on marine organisms[C]//5th Younth Annual Academic Meeting,2005.

[6]ZHENG Z H,CHEN L X,HUANG Y J,et al.Antimicrobial activity of symbiotic and epiphyte microorganisms on marine organisms in intertidal zone of Xiamen[J].Journal of Oceanography in Taiwan Strait, 1998,4:12-15.

[7]謝新強(qiáng)，林海鵬，閻冰，等.海洋動物共附生微生物抗B16腫瘤細(xì)胞活性菌株的篩選[J].中國海洋藥物，2006，25（6）：26-30.

[8]馬悅欣，于作鎮(zhèn)，于書渤，等.大連海區(qū)潮間帶海藻附生細(xì)菌的抗真菌活性[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報，2005，22（1）：11-15.

[9]DEVEREUX R,HE S H,DOYLE C L,et al.Diversity and origin of Desulfovibrio species：phylogenetic definition of a family[J].J Bacteriol, 1990,172(7):3609-3619.

[10]FRY N K,WARWICK S,SAUNDERS N A,et a1.The use of 16S ribosomal RNA analyses to investigate the phylogeny of the family Legionellaceae[J].J Gen Microbiol,1991,137(5):1215-1222.

[11]URAKAMI T,ARAKI H,OYANAGI H,et al.Paracoccus aminophilus sp.nov.andParacoccus aminovoranssp.nov.,which utilize N, N-dimethylformamide[J].Int J Syst Bacteriol,1990,40(3):287-291.

[12]LABRENZ M,COLLINS M D,LAWSON P A,et al.Roseovarius toleransgen.nov.,sp.nov.,a budding bacterium with variable bacteriochlorophyll a production from hypersaline Ekho Lake[J].Int J Syst Bacteriol,1999,49(1):137-147.

[13]GOSINK J J,WOESE C R,STALEY J T.Polaribacter gen.nov.,with three new species,P.irgensiisp.nov.,P.franzmanniisp.nov.andP.filamentussp.nov.,gas vacuolate polar marine bacteria of the Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides group and reclassification of‘Flectobacillusglomeratus’asPolaribacter glomeratuscomb.nov[J].Int J Syst Bacteriol,1998,48(1):223-235.

[14]QUAN Z X,XIAO Y P,ROH S W,et al.Joostella marina gen.nov.,sp. nov.,a novel member of the family Flavobacteriaceae isolated from the East Sea[J].Int J Syst Evol Microbiol,2008,58(6):1388-1392.

[15]CHAKRABORTY S,NAIR G B,SHINODA S.PathogenicVibriosin the natural aquatic environment[J].Rev Environ Health,1997,12(2): 63-80.

[16]GAUTHIER G,GAUTHIER M,CHRISTEn R.Phylogenetic analysis of the generaAlteromonas,Shewanella,andMoritellausing genes coding forsmall-subunitrRNAsequencesanddivisionofthegenusAlteromonas into two genera,Alteromonas(emended)andPseudoalteromonasgen. nov.,and proposal of twelve new species combinations[J].Int J Syst Bacteriol,1995,45(4):755-761.

[17]郭秀春，鄭立，王小如.?；呓z氨酸內(nèi)酯類化合物誘導(dǎo)細(xì)菌NJ6-3-1抗菌物質(zhì)代謝的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2012（6）：1350-1353.

[18]WILKINSON C R.Immunological evidence for the Precambrian origin of bacterial symbioses in marine sponges[J].Proc R Soc Lond B,1984, 220(1221):509-518.

[19]VACELET J,BOURY-ESNAULT N,FIALA-MEDIONI A,et al.Carnivorous sponges[J].Nature(Lond.)，373(6512):333-335.

[20]向怡卉，蘇秀榕，董明敏，等.海參細(xì)菌的分離鑒定和生長特性研究[J].中國食品學(xué)報，2006，6（1）：25-29.

Isolation and diversity analysis of symbiotic heterotrophic bacteria of green sea anemone in Weihai offshore

DONG Xuemin,CONG Peiyun*

(Weihai Product Quality Supervision and Testing Institute,Weihai 264209,China)

In this paper,the total symbiotic heterotrophic bacteria of the green sea anemone was studied.From the surface of the sea anemone and homogenate,60 heterotrophic bacterial strains were isolated by 16S rRNA gene sequence analysis and some physiological and biochemical test,to determine the genus of 56 strains.In addition,the production of extracellular enzyme andVibrioantagonism situation were determined as well.Results showed that the structure diversity of the culture strains community was relatively abundant,16 strains werePseudoalteromonasand related species,other strains were mainly distributed in 19 genuses.Among them,17 strains could produce extracellular proteolytic enzyme;20 strains could produce extracellular lipase;and strains NQ8 had strong antagonism to someVibrio.

green sea anemones;bacterial diversity;16S rRNA genes;phylogene;identification

Q93

A

0254-5071（2014）07-0135-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.031

2014-05-20

董雪敏（1985-），女，助理工程師，本科，研究方向為海洋食品開發(fā)利用和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定。

*通訊作者：叢培云（1962-），男，研究員，本科，研究方向為食品檢驗。