王志國，李從發(fā)，鐘春燕，向東，王錫彬

（1.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228；2.海南椰國食品有限公司，海南?？?70311）

篩網(wǎng)對木葡糖醋桿菌變異的控制

王志國1，李從發(fā)1，鐘春燕1，向東1，王錫彬1

（1.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228；2.海南椰國食品有限公司，海南?？?70311）

以1 000 mL燒杯為容器，木葡糖醋桿菌在靜置培養(yǎng)時，培養(yǎng)液體積為100 mL時，沒有變異；增至300 mL時，發(fā)生變異，纖維素產(chǎn)量下降38.8%，培養(yǎng)液體積增至700 mL時，變異菌數(shù)量高達1.3×106CFU/mL，纖維素產(chǎn)量下降76.3%；120 r/min振蕩培養(yǎng)更易發(fā)生變異，兩種方式培養(yǎng)下的變異現(xiàn)象通過篩網(wǎng)使用而得到控制，從而提高了纖維素產(chǎn)量。

木葡糖醋桿菌；變異；篩網(wǎng)

木葡萄醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）產(chǎn)生的纖維素稱為細菌纖維素（bacterial cellulose，BC），因其純度、結(jié)晶度、持水力、楊氏模量高及生物相容性好等獨特性能，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、造紙、音響等領(lǐng)域[1-3]。

利用木葡萄醋桿菌（Ga.xylinus）生產(chǎn)BC的方式主要有靜置培養(yǎng)和攪拌培養(yǎng)2種。攪拌培養(yǎng)法容易在工業(yè)發(fā)酵罐中進行，而且克服了靜置培養(yǎng)中的諸如勞動強度大，占空間，生產(chǎn)效率低下等缺點，因此得以廣泛研究[4-6]。但攪拌培養(yǎng)法往往不能獲得如靜置培養(yǎng)中的膜狀BC，而呈現(xiàn)球狀、星狀、絮狀，而且攪拌培養(yǎng)中因為剪切力的存在，往往產(chǎn)生負變異菌株，導(dǎo)致BC產(chǎn)量降低，但剪切力如何使其變異的機制尚不清楚[7-8]。

目前國內(nèi)外控制變異菌的主要方法是篩選適合攪拌培養(yǎng)的菌株，比如Ga.xylinusBPR2001在攪拌培養(yǎng)中很穩(wěn)定。在研究Ga.xylinus靜置[9]及攪拌培養(yǎng)中的變異問題時發(fā)現(xiàn)，2種培養(yǎng)方式條件下的變異現(xiàn)象，可以通過安裝篩網(wǎng)得以控制，在靜置培養(yǎng)中篩網(wǎng)的作用類似于淺層培養(yǎng)，因為Ga.xylinus在淺層培養(yǎng)中很穩(wěn)定，在攪拌培養(yǎng)中，篩網(wǎng)起到了黏附纖維素的作用，從而減弱了剪切力對菌體的破壞，從而提高了BC產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木葡萄醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）：海南大學(xué)食品學(xué)院分離保存。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖2.0 g、蛋白胨0.5 g、酵母膏0.5 g、檸檬酸0.115 g、磷酸氫二鈉0.27 g，加入100 mL水中，pH 5.0，121℃滅菌20 min。

固體培養(yǎng)基：上述液體培養(yǎng)基中加入2.0 g瓊脂。

葡萄糖、檸檬酸、磷酸氫二鈉均為分析純：天津大茂化學(xué)試劑廠；蛋白胨、酵母膏、瓊脂：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；YX280A手提式不銹鋼蒸汽消毒器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；SHP-1500生化培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SHZ-82氣浴恒溫振蕩器：常州市華普達教學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子液制備及培養(yǎng)

種子液制備：固體培養(yǎng)基上在30℃條件下培養(yǎng)10 d，挑取10個菌落接入100 mL液體培養(yǎng)基中，30℃條件下，靜置培養(yǎng)4 d。

培養(yǎng)方法：種子液按體積分數(shù)5%接入液體培養(yǎng)基中，30℃條件下靜置培養(yǎng)或120 r/min搖床振蕩培養(yǎng)4 d。

1.3.2 篩網(wǎng)的制作

靜置培養(yǎng)用篩網(wǎng)的制作：用孔徑為1 mm的不銹鋼篩網(wǎng)作材料，中間打1小孔，使其易插入玻璃棒，玻璃棒下端插入至膠塞中，使篩網(wǎng)便于放置在1 000 mL燒杯中（見圖1A），篩網(wǎng)離液面的高度視培養(yǎng)液體積而定，當(dāng)培養(yǎng)液為300 mL時，則使篩網(wǎng)處于200 mL處，以此類推，調(diào)節(jié)篩網(wǎng)的高度，使其適合于500 mL及700 mL培養(yǎng)液的使用。

振蕩培養(yǎng)用篩網(wǎng)的制作：選取同靜置培養(yǎng)一樣的材料，根據(jù)燒杯的大小裁成長方形，其在燒杯中的高度約高于培養(yǎng)液的液面1 mm（見圖1B）。

圖1 靜置(A)及振蕩(B)培養(yǎng)篩網(wǎng)Fig.1 Beakers with stainless steel mesh filter used forGa.xylinus under stationary cultivation(A)and shake cultivation(B)

1.3.3 分析方法

變異菌的計數(shù)：培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋后，涂布于瓊脂平板上，根據(jù)變異菌落的形態(tài)特征計數(shù)。

細菌纖維素（BC）的產(chǎn)量測定：收集纖維素，置于80℃、0.1 mol/L NaOH溶液中，維持2 h，冷卻后用0.1 mol/L HCl中和，自來水充分洗滌，在80℃條件下干燥至質(zhì)量恒定[10]，稱細菌纖維素質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 變異菌與正常菌的差異

培養(yǎng)液經(jīng)過合適稀釋，取0.1mL涂布于固體培養(yǎng)基上，30℃條件下培養(yǎng)7 d，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，變異菌與正常菌的菌落外觀差異顯著，正常菌的菌落小而凸起，表面干燥，變異菌的菌落扁平而大，表面濕潤。

2.2 培養(yǎng)液體積對Ga.xylnius靜置培養(yǎng)中的變異及其BC

產(chǎn)量的影響

以1000mL燒杯為容器，木葡萄醋桿菌在靜置培養(yǎng)時，培養(yǎng)液體積分別為100 mL、300 mL及700 mL，在30℃條件下靜置培養(yǎng)4 d，對Ga.xylinus靜置培養(yǎng)中的變異菌數(shù)及其細菌纖維素產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖3。

圖2 正常(A)及變異(B)Ga.xylinus菌落的形態(tài)Fig.2 Colonial morphology of normal strain(A)and abnormal strain(B)ofGa.xylinus

圖3 培養(yǎng)液體積對Ga.xylinus靜置培養(yǎng)中變異菌數(shù)量及BC產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of media volumes on mutant bacterial number and BC yield ofGa.xylniusunder stationary cultivation

由圖3可知，靜置培養(yǎng)過程中，變異菌數(shù)量與培養(yǎng)液體積負相關(guān)。培養(yǎng)液體積為100 mL時，Ga.xylinus未發(fā)生變異，培養(yǎng)液體積為300mL時，變異菌數(shù)量達到6×105CFU/mL，培養(yǎng)液體積為700 mL時，變異菌數(shù)量達到1.3×106CFU/mL，這與先前的實驗結(jié)論一致[9]。靜置培養(yǎng)中，細菌纖維素BC產(chǎn)量與培養(yǎng)液體積負相關(guān)。BC產(chǎn)量的差異達到極顯著（P＜0.01）。培養(yǎng)液體積為700mL時，BC產(chǎn)量僅為0.19 g/L，其大小只有培養(yǎng)液體積為100 mL時（0.80 g/L）的1/5。

研究表明，Ga.xylinus靜置培養(yǎng)時，BC產(chǎn)量與氣/液界面的面積正相關(guān)，與培養(yǎng)液體積無關(guān)，因為在氣/液界面有充足的氧氣，Ga.xylinus能很好地生長繁殖及產(chǎn)生BC[11-12]。但SURMA-LUSARSKAB等[13]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液體積在50～200mL之間變化時，BC產(chǎn)量與培養(yǎng)液體積負相關(guān)。出現(xiàn)這些不一致的結(jié)論的可能原因就在于所用的菌株是否在靜置培養(yǎng)條件下發(fā)生了變異。

不發(fā)生變異時，決定BC產(chǎn)量的關(guān)鍵因子為氣/液界面面積，而如果有變異菌株，BC產(chǎn)量則隨培養(yǎng)液體積增加而減小。本實驗中，培養(yǎng)液體積越多，BC產(chǎn)量越少，其原因是因為變異菌數(shù)越多。

2.3篩網(wǎng)對Ga.xylnius靜置培養(yǎng)中變異現(xiàn)象的抑制

當(dāng)在靜置培養(yǎng)液（300 mL、500 mL、700 mL）中安裝篩網(wǎng)后，變異現(xiàn)象消失，且BC產(chǎn)量相差不大，結(jié)果見表1。

表1 篩網(wǎng)對Ga.xylinus靜置培養(yǎng)的變異菌數(shù)及BC產(chǎn)量的影響Table 1 Effects of mesh filter on mutant bacterial number and BC yield ofGa.xylinusunder stationary cultivation

由表1可知，BC產(chǎn)量相差不大的原因在于不同體積的培養(yǎng)液中，氣/液界面面積皆為78.5 cm2，而氣/液界面為細胞生長繁殖及產(chǎn)BC的最活躍層[14]，因此產(chǎn)量相當(dāng)。而沒有安裝篩網(wǎng)，不同體積的培養(yǎng)液中盡管表面積一樣，但由于變異菌的出現(xiàn)，變異菌在表面占有生長優(yōu)勢，導(dǎo)致BC產(chǎn)量下降，培養(yǎng)液體積越大，變異菌數(shù)量越多，因此BC產(chǎn)量更低。

2.4 篩網(wǎng)對Ga.xylnius振蕩培養(yǎng)中變異現(xiàn)象的抑制

表2 篩網(wǎng)對Ga.xylinus靜置及振蕩培養(yǎng)中變異菌數(shù)及BC產(chǎn)量的影響Table 2 Effects of mesh filter on mutant bacterial number and BC yield ofGa.xylinusunder stationary cultivation and shake cultivation

由表2可知，在1 000 mL燒杯中培養(yǎng)液體積500 mL時，在30℃條件下靜置及120 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，Ga.xylnius衰退菌數(shù)量分別為1.2×106CFU/mL，3.5×106CFU/mL，二者差異極顯著（P＜0.01），說明振蕩培養(yǎng)更易使Ga.xylinus變異，這與前人的結(jié)論相符[15]；靜置培養(yǎng)中BC產(chǎn)量（0.28 g/L）約是振蕩培養(yǎng)中（0.03 g/L）的9倍，說明靜置培養(yǎng)中BC量比振蕩培養(yǎng)中高。

使用篩網(wǎng)后，2種培養(yǎng)方式中的變異都得到了控制（見表2），但BC產(chǎn)量差異仍極顯著（P＜0.01）。通常認為振蕩培養(yǎng)產(chǎn)BC效率低的原因是變異菌株的出現(xiàn)[7-8]，但從本實驗結(jié)果看，即使沒有變異現(xiàn)象，振蕩培養(yǎng)產(chǎn)BC效率仍較低（0.20 g/L），似乎振蕩培養(yǎng)BC產(chǎn)量低應(yīng)有另外的原因。

振蕩培養(yǎng)中的剪切力作用，使Ga.xylnius易變異[7-8]，而篩網(wǎng)可以截留攜帶BC的細胞，使其定居下來，順利地在篩網(wǎng)上成膜，培養(yǎng)液體積為500 mL振蕩培養(yǎng)中，在篩網(wǎng)上產(chǎn)生的膜狀BC，消除或者抑制了剪切力對菌株的不良影響，從而抑制變異產(chǎn)生。

3 結(jié)論

Ga.xylinus在靜置培養(yǎng)時，培養(yǎng)液體積越大，變異越容易發(fā)生，從而導(dǎo)致BC產(chǎn)量降低，篩網(wǎng)的安裝，可以消除變異現(xiàn)象，此時培養(yǎng)液體積300～700 mL皆可，但所獲得的BC量差異不大；振蕩培養(yǎng)比靜置培養(yǎng)更容易發(fā)生變異，篩網(wǎng)安裝能消除變異現(xiàn)象，從而提高BC的產(chǎn)量。靜置培養(yǎng)中篩網(wǎng)的作用類似于淺層培養(yǎng)，因為Ga.xylinus在淺層培養(yǎng)中很穩(wěn)定，在攪拌培養(yǎng)中，篩網(wǎng)起到了黏附纖維素的作用，從而減弱了剪切力對菌體的破壞，從而提高了BC產(chǎn)量。

[1]SHODA M,SUGANO Y.Recent advances in bacterial cellulose production[J].Biotechnol Bioproc Eng,2005,10(1):1-8.

[2]SANI A,DAHMAN Y.Improvements in the production of bacterial synthesized biocellulose nanofibres using different culture methods[J].J Chem Technol Biotechnol,2010,85(2):151-164.

[3]POKALWAR S U,MISHRA M K,MANWAR A V.Production of cellulose byGluconacetobactersp.[J].Recent Res Sci Technol,2010,2(7): 14-19.

[4]周伶俐，孫東平，吳清杭，等.不同培養(yǎng)方式對細菌纖維素產(chǎn)量和結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響[J].微生物學(xué)報，2007，47（5）：914-917.

[5]馬霞，王瑞明，察可文，等.氣升罐發(fā)酵生產(chǎn)細菌纖維素的動力學(xué)模型的確定[J].食品研究與開發(fā)，2006，27（7）：64-67.

[6]CHOI C N,SONG H J,KIM M J,et al.Properties of bacterial cellulose produced in a pilot-scale spherical type bubble column bioreactor[J]. Korean J Chem Eng,2009,26(1):136-140.

[7]CHAWLA P R,BAJAJ I B,SURVASE S A,et al.Microbial cellulose: fermentative production and applications[J].Food Technol Biotechnol, 2009,47(2):107-124.

[8]楊雪霞，董超，陳琳，等.剪切力對木葡糖醋桿菌及細菌纖維素合成的影響[J].纖維素科學(xué)與技術(shù)，2013，21（2）：9-14.

[9]吳謙，謝必祺，劉耀謙，等.木葡糖醋桿菌靜置培養(yǎng)中的衰退現(xiàn)象初探[J].中國釀造，2013，32（5）：19-21.

[10]王志國，鐘春燕，王錫彬，等.椰子水自然發(fā)酵條件對細菌纖維素生產(chǎn)的影響[J].中國釀造，2009，28（4）：32-34.

[11]MASAOKA S,OHE T,SAKOTA K.Production of cellulose from glucose byAcetobacter xylinum[J].J Fermentation Bioeng,1993,75(1): 18-22.

[12]GOH W N,ROSMA A,KAUR B,et al.Fermentation of black tea broth (Kombucha):I.Effects of sucrose concentration and fermentation time on the yield of microbial cellulose[J].Int Food Res J,2012,19(1): 109-117.

[13]SURMA-LUSARSKAB,PRESLERS,DANIELEWICZD.Characteristics of bacterial cellulose obtained fromAcetobacter xylinumculture for application in papermaking[J].Fibres Text East Eur,2008,16(4):108-111.

[14]HORNUNG M,LUDWIG M,GERRARD A M,et al.Optimizing the production of bacterial cellulose in surface culture:evaluation of substrate mass transfer influences on the bioreaction(Part 1)[J].Eng Life Sci,2006,6(6):537-545.

[15]KRYSTYNOWICZ A,KOZIOLKIEWICZ M,WIKTOROWSKA-JEZIERSKA A,et al.Molecular basis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture ofAcetobacter xylinum[J].Acta Biochimica Polonica,2005,52(3):691-698.

Inhibition of mesh filter on mutation ofGluconacetobacter xylinus

WANG Zhiguo1,LI Congfa1,ZHONG Chunyan2,XIANG Dong1,WANG Xibin1
(1.College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China; 2.Hainan Yeguo Foods Co.,Ltd.,Haikou 570311,China)

Using 1 000 ml beaker as container,under stationary cultivation ofGluconacetobacter xylinus,mutation didn’t occur when the loading volume was 100 ml.However,mutation ofGa.xylinusoccurred under stationary cultivation in 300 ml medium,which led to decrease of bacterial cellulose(BC)yield by 38.8%.When the medium volume increased to 700 ml,BC yield decreased 76.3%,and the mutant bacterial number was 1.3×106CFU/ml.Compared with static cultivation,mutation rates ofGa.xylinuswere higher,when shaking at 120 r/min.Mutation was inhibited by mesh filter no matter which cultivation method was used.Thereby the cellulose production was increased.

Gluconacetobacter xylinus;mutation;mesh filter

Q939

A

0254-5071（2014）11-0067-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.015

2012-09-18

海南省重大科技項目（ZDZX2013011）

王志國（1974-），男，副教授，碩士，研究方向為食品微生物。