高效液相色譜法測定篤斯越桔制品中7種有機酸的含量

魏銘，顧盼，李程潔，楊航宇，劉樹勛，張嘉月，顏志秀，張柏林，朱保慶

（北京林業(yè)大學生物科學與技術學院食品科學系，林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，北京100083）

高效液相色譜法測定篤斯越桔制品中7種有機酸的含量

魏銘，顧盼，李程潔，楊航宇，劉樹勛，張嘉月，顏志秀，張柏林，朱保慶*

（北京林業(yè)大學生物科學與技術學院食品科學系，林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，北京100083）

采用高效液相色譜方法測定6種篤斯越桔制品中的有機酸含量，色譜條件為色譜柱：Venusil ASB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相：96.9%超純水-3%甲醇-0.1%甲酸；流速：0.5 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：210 nm；進樣量：20 μm。該方法能夠快速、準確地分離篤斯越桔相關制品中所含的7種有機酸，包括草酸、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸。檢測結果表明，篤斯越桔中的有機酸主要為奎寧酸，其次是檸檬酸和蘋果酸，乳酸和乙酸的含量較少。

篤斯越桔制品；有機酸；高效液相色譜法

藍莓屬于杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）植物，其果實不僅營養(yǎng)豐富，而且含有有機酸、氨基酸、花色苷等獨特的功能性成分[1-4]，具有防治心血管疾病、抗癌、抗衰老等多種功效[5-8]。有機酸是藍莓果實中重要的營養(yǎng)和風味成分，它的種類和含量是衡量果實及相關產品品質的重要指標[9]。因此，準確測定藍莓及其相關制品中有機酸的組成對研究藍莓果實的風味特征及加工特性具有重要意義。

篤斯越桔（Vaccinium uliginosumL.）是大小興安嶺地區(qū)特有的一種野生藍莓，有著很高的營養(yǎng)和保健價值[10]。目前，藍莓及其制品中有機酸含量的相關報道多數(shù)集中在栽培種高叢藍莓和矮叢藍莓[11-14]，有關篤斯越桔中有機酸的含量檢測尚無研究報道。本研究采用高效液相色譜方法系統(tǒng)分析了以篤斯越桔為原料制備的汁、果醬及發(fā)酵果酒中有機酸的組成和含量，該研究為進一步深入認識篤斯越桔產品酸感形成的機制奠定了基礎，也對篤斯越桔加工產品的開發(fā)有較強的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓果汁（鮮榨汁）、大興安嶺藍莓果醬：內蒙古呼倫貝市鄂倫春自治旗原生態(tài)公司；大興安嶺2013年發(fā)酵酒的桶儲和瓶儲樣品、大興安嶺2014年發(fā)酵酒樣、小興安嶺2013發(fā)酵瓶儲酒樣：北京林業(yè)大學食品科學系中試產品。

L-蘋果酸、草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸：美國Sigma-Aldrich公司；奎寧酸、莽草酸：成都曼思特生物科技有限公司。以上試劑均為色譜純。

1.2 儀器與設備

LC-20 AT型高效液相色譜儀（配SPD-M20A二極管陣列檢測器）：日本島津公司；Venusil ASB C18色譜柱：天津博納艾杰爾科技有限公司；Milli-Q Academic超純水器：百壹星辰（北京）生物科技有限公司；FA（N）/JA（N）系列電子分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；TGL-16G臺式高速離心機：上海菲恰爾分析儀器有限公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

用超純水將各有機酸標準品配成單標，分別進樣，確定各自的出峰時間和先后順序，然后配制9種物質的混合標準儲備溶液，各組分的質量濃度見表1。使用時將混合溶液用超純水依次稀釋2.0倍、2.5倍、3.3倍、5.0倍、10.0倍，得到不同質量濃度梯度的標準溶液，經0.45 μm濾膜過濾后，進樣20 μL，以峰面積為縱坐標，各組分質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

表17 種有機酸混合標準溶液的組成Table 1 Mixed standard solution of seven compounds

1.3.2 樣品前處理方法

進樣前取1mL樣品，10000r/min離心10min，經0.45μm濾膜過濾，取上清液稀釋一定倍數(shù)后進行高效液相檢測。

1.3.3 定性與定量

在相同的色譜條件下，將樣品色譜圖與有機酸混標的色譜圖進行對照，根據(jù)保留時間確定樣品中各有機酸組分的色譜峰，結合有機酸的標準曲線，對樣品中的有機酸進行定量。

1.3.4 色譜條件

色譜柱Venusil ASB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：96.9%超純水-3.0%甲醇-0.1%甲酸；流速：0.5 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：210 nm；進樣量：20 μL。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立

在1.3.4的色譜條件下，對7種有機酸的混合標準溶液進樣，得到混標的色譜圖見圖1。

圖1 混合標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution

由圖1可知，各物質分離度較好，出峰順序和出峰時間為草酸（6.406 min）、奎寧（7.173 min）、蘋果酸（8.575 min）、莽草酸（9.154 min）、乳酸（9.595 min）、乙酸（10.313 min）、檸檬酸（13.690 min），所有樣品在20 min內出峰完畢。

依次測定梯度稀釋的有機酸混標，以各有機酸質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸，并計算相關系數(shù)，結果如表2所示。

表27 種有機酸的回歸方程和線性范圍Table 2 Regression equations and linear range of seven organic acids

由表2可知，各組分在相應的線性范圍內，相關系數(shù)R為0.998 7～0.999 9，表明線性關系良好，檢測限為2.50～241.80 mg/L，能滿足定量分析的要求。

2.2 6種藍莓制品中有機酸含量的檢測

本實驗對6種篤斯越桔制品中的有機酸進行定量分析，高效液相色譜圖分別見圖2及圖3，有機酸含量分析結果見表3。

由表3可知，篤斯越桔制品中的有機酸以奎寧酸為主，其次是蘋果酸和檸檬酸，草酸、莽草酸的含量很低，乳酸和乙酸則幾乎沒有檢出。魏鑫等[15]的研究主要分析了4種常見栽培藍莓果實斯巴坦（Spartan）、伯克利（Berkeley）、澤西（Jersey）和北陸（Northland）中所含的有機酸主要是檸檬酸和蘋果酸；PHILLIPS M M等[13]從北高叢藍莓（Vaccinium corymbosum）SRM3287果實中檢測到奎寧酸（2.696±0.095）mg/g，但含量要低于檸檬酸（3.19±0.14）mg/g。

圖2 大興安嶺藍莓果汁(a)和果醬(b)的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of blueberry juice(a)and blueberry jam (b)made in Greater Khingan Mountains

藍莓酒樣中的有機酸種類與原料（果汁和果醬）基本相同，但含量有差別，奎寧酸、蘋果酸和檸檬酸在發(fā)酵后的酒樣中質量濃度均有所下降，而草酸和莽草酸的含量變化幅度都不大，乳酸和乙酸質量濃度依然較低。對比前后兩年的發(fā)酵酒樣可以發(fā)現(xiàn)，2014年發(fā)酵樣品中各有機酸的含量普遍比2013年的樣品高，而且經過木桶陳釀后，各組分質量濃度變化并不明顯。

圖3 4種藍莓酒樣的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of four blueberry wine samples

表3 藍莓制品中有機酸的含量測定結果(n=3)Table 3 Determination results of organic acids in different blueberry sample(n=3)

表3結果表明，奎寧酸含量遠高于蘋果酸和檸檬酸，奎寧酸、蘋果酸和檸檬酸是野生篤斯藍莓制品中含量最為豐富的有機酸。

2.3 回收率實驗

以大興安嶺藍莓果汁為基底進行加標回收實驗，在樣品中分別加入蘋果酸、奎寧酸和檸檬酸，經0.45 μm濾膜過濾后直接進樣，結果見表4。

表4 藍莓果汁中有機酸的加標回收實驗結果Table 4 Adding standard recoveries results of organic acids in blueberry juice

由表4可知，各有機酸的加標回收率為82%～110%，表明本方法準確度高，重現(xiàn)性較好。

3 結論

本實驗采用Venusil ASB C18色譜柱，建立了同時測定篤斯越桔制品中7種有機酸的定性和定量方法，該方法準確可靠，實現(xiàn)了對6種藍莓制品中有機酸高效、快速、準確的檢測。檢測結果表明，篤斯越桔果汁、果醬和果酒中的有機酸主要為奎寧酸、蘋果酸和檸檬酸3種，其中奎寧酸含量最多，乳酸和乙酸的含量很少；在發(fā)酵后的果酒中奎寧酸、蘋果酸和檸檬酸的含量均有所下降。各有機酸的加標回收率為82%～110%，表明本方法準確度高，重現(xiàn)性較好。本研究建立的方法可以為篤斯越桔產品中有機酸的定性定量檢測提供借鑒，對利用野生藍莓為原料開發(fā)相關產品具有重要意義。

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Determination of 7 organic acids inVaccinium uliginosumproducts by HPLC

WEI Ming,GU Pan,LI Chengjie,YANG Hangyu,LIU Shuxun,ZHANG Jiayue,YAN Zhixiu,ZHANG Bolin,ZHU Baoqing*
(Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety,Department of Food Science,School of Biological Science&Technology, Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

A HPLC method was developed to determine organic acids in 6Vaccinium uliginosumproducts.The HPLC separation was achieved on C18column(4.6 mm×250 mm,5 μm)at room temperature.The mobile phase was 96.9%ultrapure water-3%methanol-0.1%formic acid at a flow rate of 0.5 ml/min.The detection wavelength was set as 210 nm and sample size was 20 μl.Seven organic acids could be successfully separated from V.uliginosumproductsusing this method,including oxalic acid,quinic acid,malic acid,shikimic acid,lactic acid,acetic acid and citric acid.The results indicated that the main organic acid existing inV.uliginosumproducts was quinic acid,followed by citric acid and malic acid;the contents of lactic acid and acetic acid were quite low.

Vaccinium uliginosumproducts;organic acids;HPLC

O657.7

A

0254-5071（2014）11-0145-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.033

2014-09-11

國家自然科學基金青年項目（C150101）；中央高校基本科研業(yè)務費專項資金（BLX2012040）；北京林業(yè)大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃（X1310022033）

魏銘（1991-），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物與生物技術。

*通訊作者：朱保慶（1982-），男，講師，博士，研究方向為食品生物技術。