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（1.傳染病預防控制國家重點實驗室，中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，北京 102206；2.貴州省黔南州人民醫(yī)院檢驗科，貴州 558000；3. 湖南省懷化市婦幼保健院， 湖南懷化 418000；4．貴陽醫(yī)學院微生物學教研室，貴州貴陽 550004）

某屠宰場豬糞便中單增李斯特菌攜帶調查

劉凱1，王艷1，王天姝2，賀春月3，代航1，于波1，袁雪嬌1，葉正興1，王毅1，許華青4，孟雙1，葉長蕓1

（1.傳染病預防控制國家重點實驗室，中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，北京 102206；2.貴州省黔南州人民醫(yī)院檢驗科，貴州 558000；3. 湖南省懷化市婦幼保健院， 湖南懷化 418000；4．貴陽醫(yī)學院微生物學教研室，貴州貴陽 550004）

為了初步探索豬的李斯特菌攜帶情況以及屠宰加工環(huán)境中污染的可能性，并進一步對分離到的單增李斯特菌進行分型分析，以了解其分子流行病學特征，為預防控制食源性李斯特菌病提供參考。2011年3月至2012年2月每月月初定點采集某一屠宰場的豬糞便標本和加工場所環(huán)境水樣標本，進行李斯特菌的病原學分離，對分離到的單增李斯特菌進行血清分型、多位點序列分型（MLST）和脈沖場電泳分型（PFGE）分析。1322份豬糞便標本和104份環(huán)境標本中，共分離到7株單增李斯特菌、56株無害李斯特菌。5株單增李斯特菌屬于1/2c血清型（ST9型），1株1/2a血清型（ST199型），1株1/2b血清型（ST5型）。4株1/2c型菌株具有完全相同的PFEG帶型，與另外1株1/2c型菌株具有相似帶型，而與其他2株菌株（分別為1/2a型和1/2b型）的帶型具有較大差異。豬的單增李斯特菌攜帶率較低，但存在污染加工環(huán)境的可能性，進而導致生豬肉食品受到污染。對屠宰及加工場所采取有效的消毒滅菌措施能夠避免單增李斯特菌的污染和傳播。

單增李斯特菌；豬糞便標本；分子分型

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一種重要的食源性病原菌，能引起李斯特菌病。該菌廣泛分布于各種環(huán)境中，如一些野生或家養(yǎng)的牲畜、鳥類、昆蟲、土壤、污水以及蔬菜中[1]。感染該菌后，能夠使免疫力低下人群出現(xiàn)敗血癥、腦膜炎等較為嚴重的感染癥狀，導致孕婦流產、胎兒早產或死產、新生兒腦膜炎和敗血癥。免疫力正常人群，在食入一定量單增李斯特菌污染的食品后，也可能會出現(xiàn)發(fā)熱性胃腸炎癥狀[2]。

單增李斯特菌是我國食源性病原菌監(jiān)測的必檢項目之一，各地食品檢測結果顯示肉類食品中單增李斯特菌的污染率較高[3-4]。導致肉類食品污染有兩種可能：食用動物本身攜帶了單增李斯特菌；在動物屠宰及肉類加工過程中被外源單增李斯特菌污染。為了解進入市場前豬的單增李斯特菌攜帶情況以及對加工環(huán)境污染的可能性，本研究選擇一個生豬屠宰場進行了連續(xù)一年的采樣及病原檢測。每月采集豬的糞便及環(huán)境標本，針對李斯特菌進行分離鑒定，并對分離到的單增李斯特菌進行了血清型與分子分型分析。

1 材料與方法

1.1 標本采集 2011年3月至2012年2月，每月（1-6日）于某屠宰場進行豬糞便標本及環(huán)境標本采集。該屠宰場規(guī)模較大，每日屠宰量約為3000頭，采集的地點集中在內臟分離車間。共采集到1322份豬糞便標本，104份環(huán)境標本（取自臺面水和地面污水）。

1.2 菌株分離培養(yǎng) 無菌棉簽多點蘸取糞便標本，環(huán)境水樣標本吸取500μL，接種至5 mL Halffraser增菌液，30℃，220 r/min恒溫搖床培養(yǎng)24 h。將Half-fraser增菌液中的培養(yǎng)物接種至Fraser增菌液，30℃，220 r/min恒溫搖床培養(yǎng)24 h。將Fraser增菌液中的培養(yǎng)物接種至李斯特菌顯色固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落（周圍有透明圈的藍色菌落和沒有透明圈的藍色菌落）至腦心浸液固體培養(yǎng)基中純化。

1.3 菌株鑒定 對經過純化的可疑菌落，采用水煮法提取DNA，即刮取少量菌落，加入100μLTE（pH8.0）中混勻，置沸水中煮10 min，再以13000 r/min離心5 min，取上清液為DNA模板。用李斯特菌屬特異性引物進行擴增（表1）[5]。25μL的反應體系包括：10×buffer 2.5μL，dNTP（dATP， dTTP， dCTP及 dGTP各 2.5mM）1.5 μL，上游引物（10μM）各0.5 μL，下游引物（10μM）1.5 μL，Taq DNA Polymerase 1U，模板100 ng，無菌去離子水補充至25 μL。擴增反應參數(shù)：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，共進行30個循環(huán)； 最后72℃延伸10 min。擴增陽性的菌株用API Listeria生化試劑條按照產品說明書進行李斯特菌的種間鑒定。

表1李斯特菌屬特異性引物及單增李斯特種特異引物序列

1.4 單增李斯特菌血清型、多位點序列分型（multi-locus sequence typing，MLST）和脈沖場電 泳（pulsed-feld gel electrophoresis，PFGE） 分析 對所有分離得到的單增李斯特菌，采用日本Denka Seiken公司的血清抗體，按照產品說明書進行血清型鑒定。參照巴斯德研究所的單增李斯特菌多位點序列分型數(shù)據庫操作流程（http：// www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Lmono. html），針對單增李斯特菌7對管家基因（abcZ，blgA，cat，dapE，dat，ldh，lhkA）部分片段進行PCR 擴增并測序，得到菌株的序列型。根據美國CDC PulseNet的標準操作規(guī)程對單增李斯特菌進行脈沖場電泳分型分析，分別用兩種內切酶（AscⅠ和ApaⅠ）對菌株進行酶切，PFGE圖像用BioNumerics（Version5.0）軟件進行聚類分析。

2 結果

2.1 菌株分離情況 1322份豬糞便標本中分離到6株單增李斯特菌、17株無害李斯特菌。104份環(huán)境標本中分離到1株單增李斯特菌、39株無害李斯特菌。豬糞便和環(huán)境中李斯特菌總檢出率分別為1.74%和38.5%，其中單增李斯特菌的檢出率分別為0.45%和0.96%。單增李斯特菌株分離時間為3、4、8月各1株，7月4株。除8月分離的菌株來自環(huán)境水樣標本我外，其余菌株均分離自豬糞便標本（圖1）。

2.2 單增李斯特菌的血清分型、MLST和PFGE分型 7株單增李斯特菌中有5株屬于1/2c血清型，另2株分別為1/2a和1/2b血清型。MLST分型結果與血清型較為一致，5株1/2c型菌株均為ST9型，1/2a型菌株為ST199型，1/2b型菌株為ST5型（圖1）。本研究采用兩種酶進行PFGE分型，共分為4種PFGE型別，其中7月份分離的4株菌屬于同一型別，并與8月份分離菌株非常相近。3、4月分離菌株與7、8月菌株帶型差異較大（圖1）。

本次調查分離到的7株單增李斯特菌中6株屬于家系Ⅱ（主要包括1/2a，1/2c，3a，3c血清型），1株屬于家系Ⅰ（主要包括1/2b和4b血清型），這與家系Ⅱ菌株相對于家系Ⅰ菌株更為廣泛存在于自然界的規(guī)律相一致[7]。張?zhí)m榮等[8]曾對同一城市的部分地區(qū)2007～2011年食品中單增李斯特菌進行檢測，其中從豬肉中分離的菌株主要為家系Ⅱ中的1/2a和1/2c血清型，提示無論豬內源性攜帶還

圖1單增李斯特菌分離株的分型結果

3 討論

本研究表明，該屠宰場加工的豬攜帶單增李斯特菌的比率較低，僅為0.45%，其攜帶率略低于日本研究人員的結果（0.8%）[6]，同時遠低于目前報道的肉類食品中單增李斯特菌的污染率[3-4]，提示肉類食品的單增李斯特菌污染很大可能發(fā)生于食品的加工、儲存直至食用的各個環(huán)節(jié)。盡管豬攜帶單增李斯特菌的情況不多見，但由于生豬加工流水作業(yè)的特殊性，一旦有攜帶單增李斯特菌的豬出現(xiàn)在加工過程中，則可能導致生產流水線下游某些區(qū)域被污染，進而造成更多豬肉被污染。應重視對動物源性單增李斯特菌污染和生肉類食品中單增李斯特菌污染的監(jiān)測。

本研究在一年的每個月初進行樣品采集和病原菌分離，并且每月標本量較為一致（100～150份），僅于3月、4月、7月和8月采集標本中分離到單增李斯特菌，由此可見相對于冬季，春夏季節(jié)較為容易分離到該菌。因為沒有對飼養(yǎng)過程中生豬帶菌情況進行調查，因此尚不能推斷豬感染單增李斯特菌的易感季節(jié)。是豬肉在加工、儲存、銷售過程中被外源環(huán)境污染都以家系Ⅱ單增李斯特菌為主。

本研究發(fā)現(xiàn)，7月分離到的4株單增李斯特菌來自連續(xù)采集的4份樣品，并具有完全一致的分子分型結果，推測可能為采集樣本的器械發(fā)生交叉污染，或者可能是一頭豬所攜帶的單增李斯特菌污染了加工處理生產線局部環(huán)境，進而導致連續(xù)生產加工的幾頭豬所采樣品被該菌株污染而檢出陽性。尤其是我們在隨后一個月（8月份）的環(huán)境水樣中分離到的1株單增李斯特菌與這4株菌具有相同的血清型和ST型，PFGE帶型圖譜略有差異，提示7月和8月份的菌株具有相近的親緣關系。單增李斯特菌具有極強的環(huán)境適應能力，能在3℃～45℃溫度范圍內和pH 4.4～9.6條件下生長，對堿和鹽具有較強的抵抗力[9]。研究顯示，單增李斯特菌在土壤、污水等環(huán)境中可以長期存活，Oris等人利用基因組測序證實兩株來自1988年和另外兩株自來2000年分離自同一加工地點的菌株具有極為相似的基因組骨架序列，提示該菌株可能在此至少存活了12年[10]。本研究在9月份及以后的采樣檢測中沒有從環(huán)境樣品中再分離出單增李斯特菌，可能與該屠宰場的消毒措施得當有關，該屠宰場具有針對加工肉產品的接觸面以及生產加工用水進行定期監(jiān)督抽測措施，以確保加工產品的安全。研究結果提示單增李斯特菌雖然具有較強的環(huán)境適應能力，及時有效的消毒措施，可以消除污染并切斷傳播途徑。

[1] Ramaswamy V， Cresence V M， Rejitha J S， et al. Listeriareview of epidemiology and pathogenesis[J]. J Microbiol Immunol Infect， 2007，40（1）： 4-13.

[2] Schlech W F. Foodborne listeriosis[J]. Clin Infect Dis，2000，31（3）： 770-775.

[3] 仝志琴，楊瓊.2010年洛陽市食源性致病菌檢測結果分析[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學， 2013， 40（1）：23-24.

[4] 董峰光， 宮春波， 王朝霞， 等. 2011年煙臺市市售肉及肉制品污染狀況調查[J].職業(yè)與健康， 2013，29（9）：1096-1098.

[5] Somer L， Kashi Y. A PCR method based on 16S rRNA sequence for simultaneous detection of the genus Listeria and the species Listeria monocytogenes in food products[J]. J Food Prot， 2003，66（9）： 1658-1665.

[6] Iida T，Kanzaki M， Nakama A， et al. Detection of Listeria monocytogenes in humans， animals and foods[J]. J Vet Med Sci， 1998，60（12）： 1341-1343.

[7] Orsi R H， den B H C， Wiedmann M. Listeria monocytogenes lineages： Genomics， evolution， ecology， and phenotypic characteristics[J]. Int J Med Microbiol， 2011， 301（2）： 79-96.

[8] 張?zhí)m榮， 王艷， 張揚， 等. 2007—2011年北京市通州區(qū)分離單增李斯特菌的生物學及分子流行病學特征[J].疾病監(jiān)測， 2012， 27（7）：562-564.

[9] Gray M L， Killinger A H. Listeria monocytogenes and listeric infections[J]. Bacteriol Rev， 1966， 30（2）： 309-382.

[10] Orsi R H， Borowsky M L， Lauer P， et al. Shortterm genome evolution of Listeria monocytogenes in a noncontrolled environment[J]. B M C Genomics， 2008（9）： 539.

Investigation of Listeria monocytogenes in Swine Stool in an Abattoir

Liu Kai1，Wang Yan1，Wang Tianshu2，He Chunyue3，Dai Hang1，Yu Bo1，Yuan Xuejiao1，Ye Zhengxing1，Wang Yi1，Xu Huaqing4，Meng Shuang1，Ye Changyun1

（1.State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control， National Institute for Communicable Disease Control and Prevention， Beijing， 102206；2.Clinical Laboratory of Qiannan People’s Hospital， Dujun Guizhou 558000， China； 3. Huaihua Maternal and Child Hospital，Huaihua Hunan， 418000；4. The Department of Microbiology of Guiyang Medical University，Guiyang Guizhou， 550004）

To fnd out the Listeria infection in swine and the contamination risks in the processing environment，1322 stools of swine and 104 environmental samples were collected for the isolation of Listeria from March 2011 to February 2012. Seven Listeria monocytogenes and ffty-six Listeria innocua were identifed. In order to understand the epidemiological characteristic of L. monocytogenes，all the seven isolates were subtyped by serotyping，multi-locus sequence typing（MLST）and pulse feld gel electrophoresis（PFGE）. Five L. monocytogenes strains belonged to 1/2c（ST9），the rest two strains were 1/2a（ST199）and 1/2b（ST5），respectively. Four of fve 1/2c serotype strains showed the same pulsotype，which was very similar with the remaining 1/2c serotype strain. The other two strains（1/2a and 1/2b serotype），showed distinct pulsotypes from that of 1/2c strains. The result showed that the infection rate of L. monocytogenes in swine was low， and the contamination of environment could possibly happen if the infected swine enter the process. The contamination and spreading of L. monocytogenes could be avoided by proper disinfection in slaughterhouse.

Listeria monocytogenes；Stool sample of swine；Molecular subtyping

R378.994

：A

：1005-944X（2014）06-0047-04

國家重大傳染病防治科技重大專項（2011ZX10004-001，2013ZX10004-101）資助

葉長蕓

注：劉凱、王艷共為第一作者