席冬華，高 晶，彭新媛，王 倩，李 玲，吳 斌,*

（1.新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆大學(xué)理化測(cè)試中心，新疆 烏魯木齊 830046；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研 究所，新疆 烏魯木齊 830091）

高壓液相色譜-質(zhì)譜法和高效液相色譜法分析籽瓜中環(huán)磷酸腺苷

席冬華1，高 晶2，彭新媛1，王 倩3，李 玲1，吳 斌3,*

（1.新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆大學(xué)理化測(cè)試中心，新疆 烏魯木齊 830046；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研 究所，新疆 烏魯木齊 830091）

采用高壓液相色譜-質(zhì)譜法鑒定籽瓜中的環(huán)磷酸腺苷，并建立高效液相色譜法測(cè)定籽瓜 中環(huán)磷酸腺苷的含量，對(duì)樣品提取條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：環(huán)磷酸腺苷在0.1～100 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9；平均加標(biāo)回收率為98.40%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.22%。經(jīng)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定優(yōu)化的提取條件為料液比1∶12（鮮樣）和1∶60（干樣）水提取，提取溫度90 ℃、提取時(shí)間40 min、提取次數(shù)3 次。樣品前處理和分析方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、可靠、重復(fù)性好，可用于籽瓜中環(huán)磷酸腺苷含量的分析測(cè)定。

籽瓜；環(huán)磷酸腺苷；高壓液相色譜-質(zhì)譜法；高效液相色譜法

環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine-3’,5’-monophosphate，cAMP）是核苷酸的衍生物，蛋白激酶致活劑，被稱為“生命第二信使”（激素為第一信使），廣泛存在有機(jī)體中的一種具有生理活性的重要物質(zhì)。醫(yī)學(xué)研究證明有40多種疾病與cAMP的代謝有關(guān)，包括癌癥、高血壓、冠心病、心肌梗塞和心源性休克[1]和帕金森綜合癥[2]等重大疾病。cAMP可以通過化學(xué)合成、微生物發(fā)酵、天然產(chǎn)物分離提取等方法獲得。化學(xué)合成cAMP的方法[3]存在化學(xué)試劑不能完全去除的隱患和環(huán)境危害；微生物發(fā)酵cAMP方法培養(yǎng)周期長，產(chǎn)物中可能含有菌體代謝產(chǎn)物[4]；而天然產(chǎn)物提取的cAMP具有綠色，無毒副作用等特點(diǎn)，具有較高的商業(yè)開發(fā)價(jià)值，從富含cAMP的植物源組織中分離檢 測(cè)cAMP是當(dāng)今研究熱點(diǎn)之一[5]。

目前，分析cAMP的方法主要有紙色譜法、薄層色

譜法[6]、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合蛋白分析法[7]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[8-9]、液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry，LC-MS-MS）法[10-12]、親水色譜-二極管陣列檢測(cè)器-電噴霧四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法[13]等。高效液相色譜法具有分析時(shí)間短、分離度好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，近幾年來得到迅速發(fā)展[14]與廣泛應(yīng)用。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道用HPLC法測(cè)定不同地區(qū)[15-16]、不同品種棗果[17-20]中的cAMP含量，但對(duì)籽瓜瓜皮和瓜瓤中cAMP的研究報(bào)道很少。

籽瓜（又稱打瓜）是葫蘆科西瓜屬普通西瓜的栽培變種，極具地域特色，中國籽瓜種植面積和產(chǎn)量均居世界之首，新疆是我國籽瓜主產(chǎn)區(qū)之一。目前，對(duì)籽瓜的利用只是做到了取籽加工，瓜籽只占鮮瓜質(zhì)量的3%～5%，其余約占瓜質(zhì)量95%以上的部分都作為廢物而被丟棄[21]，造成極大的資源浪費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)通過建立檢測(cè)籽瓜中cAMP含量的HPLC法，為籽瓜資源的深加工提供技術(shù)支持，也為植物源cAMP的研究與應(yīng)用提供新的原料來源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

籽瓜（品種：黑大片） 新疆昌吉墾區(qū)；cAMP標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%） 北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純） 霍尼韋爾貿(mào)易（上海）有限公司；磷酸二氫鉀、甲醇（分析純） 天津市福晨化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)室用水均為高純水（≥18 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

1260型HPLC儀（配有可變波長紫外檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和EZChrom Elite工作站） 美國安捷倫公司；Quattro Premier XE高壓液相色譜-質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源及MassLynx4.1軟件操作系統(tǒng)） 美國Waters公司；DZG-303A“艾柯”實(shí)驗(yàn)室專用超純水儀 成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司；Himac CR-20B2型高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；IKA A11基本型研磨機(jī) 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；LGJ-10冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；電熱恒溫水槽 上海精宏儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取0.020 0 g cAMP標(biāo)準(zhǔn)品，用高純水溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，該儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度200 mg/L，再依次配制成0.1、1、10、50、100 mg/L一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，過0.22 μm濾膜后進(jìn)樣。

1.3.2 水浴法提取cAMP

將籽瓜清洗、縱切、手動(dòng)去籽、去表皮、分離瓜皮和瓜瓤、分別冷凍、粉碎、真空干燥、保存在-80 ℃冰箱。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量籽瓜冷凍樣品，放入50 mL圓底燒瓶中；1）籽瓜冷凍鮮樣以料液比為1∶12 （g/mL）加入高純水搖勻后，在90 ℃條件下恒溫水浴40 min；2）籽瓜干樣以料液比1∶60 （g/mL）加入高純水搖勻后，在90 ℃條件下恒溫水浴40 min。分別提取2 次合并提取液10 000 r/min離心20 min，取上清液過0.22 μm濾膜后直接注入進(jìn)樣品以供分析。

1.3.3 高壓液相色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Acuity C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸（10∶90，V/V）溶液等度洗脫；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓3.0 kV；脫溶劑溫度350 ℃；錐孔氣流50 L/h；干燥氣為氮?dú)?，氣流量?50 L/h；碰撞氣體氬氣；氣體流量0.18 mL/min；電噴霧離子源；正離子模式掃描；多反應(yīng)檢測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）方式檢測(cè)。其他參數(shù)見表1。

表1 檢測(cè)cAMP的質(zhì)譜條件Table 1 MS conditions for the detection of cAMP

1.3.4 高效液相色譜條件

色譜柱：Platisil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀（15∶85，V/V）；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長259 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.5 提取條件優(yōu)化

在提取溫度90 ℃，提取時(shí)間30 min條件下，選取料液比（g/mL）：鮮樣：1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12；干樣：1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60。在料液比1∶6（鮮樣）和1∶40（干樣），提取時(shí)間30 min條件下，選取提取溫度：60、70、80、90、95、100 ℃。在料液比1∶6（鮮樣）和1∶40（干樣），提取溫度90 ℃條件下，選取提取時(shí)間：10、20、30、40、60 min。在料液比1∶6（鮮樣）和1∶40（干樣），提取溫度90 ℃，提取時(shí)間30 min條件下，選取不同提取次數(shù)：鮮樣： 1、2、3 次；干樣：1、2、3、4 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽瓜中cAMP的鑒定

對(duì)1 mg/L cAMP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行一級(jí)全掃描和子離子掃描，確定cAMP的前體離子和產(chǎn)物離子，選擇2 個(gè)豐度較高、干擾較少的子離子作為定性離子和定量離子，其MRM色譜圖如圖1A所示。將籽瓜瓤樣品按樣品處理方法處理稀釋后，進(jìn)樣10 μL，得到MRM色譜圖如圖1B所示。

圖1 cAMP標(biāo)準(zhǔn)品和籽瓜樣品MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of cAMP standard solution and seeding watermelon sample

由圖1可以看出，籽瓜樣品中目標(biāo)物質(zhì)的峰與cAMP標(biāo)準(zhǔn)品的峰保留時(shí)間在誤差范圍內(nèi)，選擇的特征離子的保留時(shí)間及豐度之比與標(biāo)準(zhǔn)品的一致，確定目標(biāo)物質(zhì)為cAMP，該方法鑒定了籽瓜樣品中含有cAMP。

2.2 cAMP提取條件優(yōu)化

純水作提取溶劑時(shí)cAMP的提取量較高[13]，故本實(shí)驗(yàn)用高純水作提取劑。影響cAMP提取量的主要因素有料液比、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)。以cAMP的提取量為指標(biāo)，采用單因素分析法對(duì)水浴提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

圖2 籽瓜鮮樣提取條件優(yōu)化圖Fig.2 Optimization of extraction conditions for flesh seeding watermelon

圖3 籽瓜干樣提取條件優(yōu)化圖Fig.3 Optimization of extraction conditions for dry seeding watermelon

由圖2、3可知，提取液使用量越大，提取量越高，但提取液使用量過高，cAMP的質(zhì)量濃度越低，質(zhì)量濃度太低會(huì)增加cAMP分離提取工作的負(fù)擔(dān)[22]，料液比選擇1∶12（鮮樣）、1∶60（干樣）。提取溫度達(dá)到90 ℃時(shí)提取量較高，提取溫度選擇90 ℃。cAMP的含量隨提取時(shí)間延長有較明顯提高，當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，cAMP含量達(dá)到最大，隨著提取時(shí)間的延長，提取量開始降低，可能由于提取時(shí)間過長，雜質(zhì)溶出，影響了cAMP的提取[23]，故選擇提取時(shí)間為40 min。不同提取次數(shù)對(duì)鮮樣中cAMP含量影響較小，干樣在提取3 次后提取量變化不明顯，鮮樣可提取2 次，干樣提取3 次。

2.3 cAMP提取因素的正交優(yōu)化

從以上單因素試驗(yàn)可以看出，提取量受料液比、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)4 個(gè)因素影響。為全面考察這4 個(gè)因素的作用大小和優(yōu)化組合，設(shè)計(jì)了L9（34）正交試驗(yàn)。結(jié)果及數(shù)據(jù)處理見表2和表3。

由表2可知，影響籽瓜鮮樣中cAMP提取率的主次因

素為A＞D＞C＞B，即料液比為最主要因素，提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)均為次要因素。從各因素極差分析結(jié)果得出最佳提取條件為A3B2C2D3，由正交試驗(yàn)可知，最優(yōu)組合為A3B2C1D3，通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確定提取工藝組合為A3B2C2D3，由于提取次數(shù)對(duì)鮮樣中cAMP提取量影響較小，最終確定提取工藝為料液比1∶12、提取溫度90 ℃、提取時(shí)間40 min、提取次數(shù)3 次。

由表3可知，影響籽瓜干樣中cAMP提取率的主次因素為D＞A＞C＞B，即提取次數(shù)是最主要因素，料液比、提取溫度和提取時(shí)間均為次要因素。從各因素極差分析結(jié)果得出最佳提取條件為A3B2C2D3，由正交試驗(yàn)可知，最優(yōu)組合為A3B2C1D3，通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)最終確定提取工藝組合為A3B2C2D3，即料液比1∶60、提取溫度90 ℃、提取時(shí)間40 min、提取次數(shù)3 次。

表 2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果（鮮樣）Table 2 Results of L9 (34) orthogonal array design (flesh sample)

表 3 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果（干樣）Table 3 Results of L9((334) orthogonal array design (dry sample)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品及籽瓜cAMP的色譜圖

cAMP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖如圖4所示。樣品進(jìn)行前處理后用HPLC進(jìn)行分析，得籽瓜瓜瓤、瓜皮鮮樣的色譜圖如圖5和圖6所示，可見cAMP信號(hào)峰能與其他雜質(zhì)峰分離且有較好峰形。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖Fig.4 Chromatogram of cAMP standard

圖5 籽瓜瓜瓤樣品HPLC色譜圖Fig.5 Chromatogram of cAMP from seeding watermelon flesh

圖6 籽瓜瓜皮樣品HPLC色譜圖Fig.6 Chromatogram of seeding watermelon rind

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

選取不同質(zhì)量濃度的cAMP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣20 μL。以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液對(duì)應(yīng)的峰面積Y和其質(zhì)量濃度X進(jìn)行線性回歸分析，得到回歸方程Y=860 341.567 13X-91 953.292 8，R=0.999 9，cAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7。結(jié)果顯示在0.1～100 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖7 cAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of cAMP

2.5.2 精密度

取質(zhì)量濃度10 mg/L的cAMP標(biāo)準(zhǔn)液自動(dòng)進(jìn)樣20 μL，平行測(cè)定5 次，測(cè)定cAMP峰面積積分值，計(jì)算平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（rel ative standard deviation，RSD），結(jié)果見表4。RSD為0.34%，說明精密度良好，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 4 Results of precise test (n =5)

2.5.3 重復(fù)性

精確稱取相同質(zhì)量的樣品5 份，制備籽瓜提取液，分別進(jìn)樣20 μL，用HPLC儀測(cè)定峰面積，計(jì)算峰面積的RSD為2.28%，結(jié)果見表5。說明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

表5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 5 Results of repeatability test (n=5)

2.5.4 回收率

精確稱取相同質(zhì)量的籽瓜瓜瓤樣品5 份，分別加入一定量的cAMP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表6所示。cAMP的回收率為92.93%～104.96%，RSD為3.22%，表明該方法能準(zhǔn)確測(cè)定籽瓜中cAMP的含量。

表6 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5）Table 6 Results of recovery test (n =5)

2.6 籽瓜樣品的測(cè)定

表7 籽瓜中cAMP的含量（n=3）Table 7 cAMP contents of the flesh and rind of seeding watermelon (n =3)

籽瓜瓜皮和瓜瓤中cAMP含量有較大區(qū)別，由表7可以看出，籽瓜瓜瓤中的cAMP含量高于瓜皮，大約是瓜皮的2～3 倍。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用高壓液相色譜-質(zhì)譜法鑒定出籽瓜中含有cAMP，并建立HPLC法測(cè)定籽瓜中cAMP的含量，精密度和準(zhǔn)確度均符合分析要求，方法回收率高、重復(fù)性好，cAMP的平均加標(biāo)回收率為98.40%，重復(fù)測(cè)定的RSD為2.28%。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)樣品提取條件進(jìn)行優(yōu)化，最終選擇提取條件：提取液為水、料液比1∶12（鮮樣）和1∶60（干樣）、提取溫度90 ℃、提取時(shí)間40 min和提取次數(shù)3 次。該研究方法能夠滿足籽瓜中cAMP定性定量分析的要求。通過對(duì)新疆黑大片籽瓜樣品中cAMP的檢測(cè)，可知籽瓜瓜瓤中的cAMP含量較高，含量達(dá)到256.86 mg/kg（md）。下一步將研究新疆不同品種籽中cAMP含量的差異，為籽瓜資源的充分利用提供依據(jù)。

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Identification and Quantitation of Cyclic Adenosine 3’,5’-monophosphate in Seeding Watermelon by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry and High Performance Liquid Chromatography

XI Dong-hua1, GAO Jing2, PENG Xin-yuan1, WANG Qian3, LI Ling1, WU Bin3,*
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang University, ürümqi 830046, China; 2. Center for Physics and Chemistry Analysis, Xinjiang University, ürümqi 830046, China; 3. Institute of Agro-products Storage and Processing, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, ürümqi 830091, China)

A method to identify cAMP using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MSMS) and to quantify the content of cAMP in seeding watermelon using high performance liquid chromatography (HPLC) was established. The quantitative method showed a good linear relationship in the cAMP concentration range from 0.1 to 100 mg/L with a correlation coefficient of 0.999 9. The average recovery for spiked samples was 98.40% with relative standard deviation (RSD) of 3.22% (n = 5). By using one-factor-at-a-time and orthogonal array designs, the optimum conditions for cAMP extraction were determined as follows: solid-to-water ratio; 1:12 (fresh sample) or 1:60 (dry sample); temperature, 90 ℃; extraction time, 40 min. This method is simple, accurate, reliable and reproducible, and can be used for the determination of cAMP in seeding watermelon.

seeding watermelon; cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate (cAMP); liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS-MS); high performance liquid chromatography (HPLC)

O657.72

A

1002-6630（2014）18-0141-05

10.7506/spkx1002-6630-201418028

2013-11-27

新疆維吾爾自治區(qū)級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（KY2013045；KY2014038）

席冬華（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分析。E-mail：553764469@qq.com

*通信作者：吳斌（1973—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：xjuwubin0320@sina.com