摘 要：采用鮮樣與冷凍樣、磷酸緩沖液與液氮研磨等不同方法處理乳熟期小麥葉片，分光光度計法測定葉片保護(hù)酶活性等指標(biāo)。結(jié)果表明：鮮樣、液氮研磨下保護(hù)酶活性最高，MDA含量最低；液氮冷凍后的可溶性蛋白含量整體低于鮮樣所測值。鮮樣液氮研磨所測生理值更接近葉片本身的實際生理情況。

關(guān)鍵詞：鮮樣；冷凍樣；磷酸緩沖液；液氮；生理指標(biāo)

逆境脅迫后，植物葉片會迅速感應(yīng)，生理生化代謝會發(fā)生一系列變化。有關(guān)逆境脅迫后小麥葉片生理生化研究已有大量文獻(xiàn)報道。在保護(hù)酶等指標(biāo)測定方法上，大多采用鮮樣加磷酸緩沖液冰浴研磨，或液氮冷凍處理后放置-86℃冰箱后再磷酸緩沖液冰浴研磨，用分光光度計進(jìn)行比色。筆者在試驗中發(fā)現(xiàn)，對于苗期幼葉研磨較容易，而對于生長中后期的葉片很難充分研磨。另外也鮮見有關(guān)不同處理方法對小麥葉片生理生化測定值影響的報道。為此，以小麥乳熟期旗葉為材料，采用鮮樣與冷凍樣、磷酸緩沖液與液氮研磨等不同處理，對葉片SOD活性等指標(biāo)進(jìn)行測定，以期為植物葉片生理指標(biāo)準(zhǔn)確測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)

試驗于2013～2014年在西北農(nóng)林科技大學(xué)進(jìn)行。選用小偃22為供試材料，2013年10月7日播種，日常管理參照大田。小麥開花期對同一天開花、旗葉大小相對均勻的麥穗掛牌標(biāo)記，花后14天（小麥進(jìn)入籽粒乳熟期）取掛牌標(biāo)記的所有旗葉，放入冰盒后迅速帶回實驗室。自來水沖洗，冰上將混合樣分成4份備用。

1.2 試驗設(shè)計

采用4種不同方式進(jìn)行研磨。鮮樣、磷酸緩沖液研磨，鮮樣、液氮研磨，液氮處理、磷酸緩沖液研磨，液氮處理、液氮研磨。其中，液氮處理為將葉片在液氮中冷凍10分鐘后轉(zhuǎn)入-86℃冰箱冷凍2小時，液氮研磨為充分研磨后再加等量磷酸緩沖液，其余步驟均相同。

1.3 測定指標(biāo)與方法

SOD活性測定采用氮藍(lán)四唑法，POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，CAT活性采用過氧化氫法，可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法，MDA含量測定采取硫代巴比妥酸。以上生理指標(biāo)測定方法參考姜麗娜等方法。每個指標(biāo)6次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Excel2003整理數(shù)據(jù)，SAS8.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方法對小麥葉片保護(hù)酶活性的影響

由圖1可得，不同處理方法下小麥葉片保護(hù)酶活性呈相同變化趨勢。其中，均為A1B2處理下SOD、POD和CAT活性最高，依次為502.79單位/克、137.02單位/克和52.87單位/克，其次為A2B2，A1B1處理下3種酶活性最低?？梢娨旱幚碛兄谌~片維持較高地保護(hù)酶活性。

2.2 不同處理方法對小麥葉片可溶性蛋白和MDA含量的影響

由圖2可得，不同處理方法下小麥葉片可溶性蛋白和MDA含量呈不同變化趨勢。其中，可溶性蛋白在A1B1處理下最高，A2B1處理下最低；而葉片MDA含量在A2B1處理下最高，A1B2處理下最低；處理間差異不顯著。

3 討論與結(jié)論

液氮因其本身可提供較低的溫度常用來作為保存材料的介質(zhì)。近年來涉及液氮保存的生物材料有原生質(zhì)體、愈傷組織和種子等。在超低溫環(huán)境下，植物細(xì)胞內(nèi)自由水被迅速固化，酶促反應(yīng)停止，新陳代謝被抑制，植物材料處于生理停頓狀態(tài)，這最大限度地保證了復(fù)蘇后細(xì)胞的生活力。因此本研究利用液氮處理材料是可行的。

本研究中，A1B2處理下葉片3種保護(hù)酶活性最高。這可能是液氮冷凍下研磨更徹底、提取更充分，更加接近葉片本身的實際生理情況所致。另外，A1B2處理下MDA含量最低，也佐證了試驗結(jié)果的可靠性。而液氮冷凍后的可溶性蛋白含量整體低于鮮樣所測值，可見液氮冷凍后可溶性蛋白也會發(fā)生部分分解。因此，當(dāng)樣品較少時，鮮樣液氮研磨所測生理值相對更準(zhǔn)確些。液氮冷凍時間及保存時間對葉片生理測定值的影響，則有待于進(jìn)一步研究。

基金項目：商洛學(xué)院科學(xué)與技術(shù)研究基金項目（15SKY009）。

作者簡介：張軍（1987-），男，碩士研究生，主要從事小麥抗逆生理研究。

（責(zé)任編輯 亓 國）