呂莎莎，劉寬芝

辛伐他汀降低2型糖尿病大鼠心肌Toll樣受體4表達(dá)

呂莎莎，劉寬芝

目的：觀察辛伐他汀對(duì)2型糖尿病大鼠心肌 Toll樣受體4（TLR4）表達(dá)的影響。

Toll樣受體4；辛伐他??；糖尿病心肌病變；炎癥反應(yīng)

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:64.)

糖尿病性心臟病嚴(yán)重威脅糖尿病患者的生命，約占糖尿病患者死因的70%～80%[1]。目前，天然免疫系統(tǒng)的激活和慢性低度炎癥為糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)理提供了新依據(jù)，Toll樣受體4（TLR4）是免疫反應(yīng)和介導(dǎo)炎癥的重要模式識(shí)別受體，也是聯(lián)系二者的樞紐，因此可將TLR4作為炎癥和自身免疫性疾病的治療靶點(diǎn)。辛伐他汀的抗炎作用對(duì)降低2型糖尿病患者的心血管病風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。本文探討辛伐他汀對(duì)糖尿病大鼠心肌TLR4表達(dá)的影響。

1 材料與方法

主要材料：40只雄性清潔級(jí)SD大鼠，鼠齡6周，體重為（180±20）g，購自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。鏈脲佐菌素（美國Sigma公司生產(chǎn)），辛伐他汀[默沙東制藥有限公司產(chǎn)品（批號(hào)：X920345）]，兔抗大鼠TLR4蛋白抗體（武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)），兔二步法免疫組化試劑盒（北京中杉生物科技有限公司，PV-6001），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（加拿大立陶宛Fermentas公司），脫氧核糖核酸（DNA）引物（北京賽百盛生物有限公司）。

動(dòng)物模型制備及分組：于2012-03至2013-11將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=10）和實(shí)驗(yàn)組（n=30）。其中對(duì)照組予以普通飼料，實(shí)驗(yàn)組用高糖高脂飼料（普通飼料中加入20%白砂糖、2.5%膽固醇、15%熟豬油）喂養(yǎng)。4周后，實(shí)驗(yàn)組腹腔內(nèi)一次性注射鏈脲佐菌素（30 mg/kg），對(duì)照組腹腔注射等體積的枸櫞酸緩沖液。實(shí)驗(yàn)組30只大鼠6周后測(cè)定空腹血糖＞7.8 mmol/L且伴有胰島素敏感指數(shù)降低者作為2型糖尿病大鼠模型[2]，共26只，將其隨機(jī)分為糖尿病組（n=13）和辛伐他汀組（n=13）。辛伐他汀組給予20 mg/（kg.d）辛伐他汀灌胃，對(duì)照組和糖尿病組均予等體積生理鹽水灌胃[3]，共8周。

標(biāo)本采集及生化指標(biāo)檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用10%水合氯醛（3.5 ml/kg）麻醉大鼠，心臟取血，離心，留取血清標(biāo)本，-20℃保存，待用于生化指標(biāo)的測(cè)定。迅速取部分心臟組織以4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片，待蘇木素伊紅（HE）染色和免疫組織化學(xué)染色。空腹血糖以Roch血糖儀測(cè)定；肌酸激酶及血脂采用全自動(dòng)生化分析儀（日本olympus公司生產(chǎn)）檢測(cè)；空腹胰島素水平用雙抗體放射免疫分析法檢測(cè)；胰島素敏感指數(shù)=1/（空腹血糖×空腹胰島素水平）。

光鏡觀察：切片常規(guī)脫蠟至水，HE染色3 min，自來水洗1 min，1%鹽酸乙醇分化30 s，自來水洗1 min，HE染色2 min，自來水洗1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯胺透明，中性樹脂封片，光鏡觀察。

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TLR4表達(dá)：心臟組織標(biāo)本用4%甲醛固定后脫水、浸蠟包埋、切片，按照免疫組化試劑盒說明進(jìn)行操作。一抗為1:200稀釋的TLR4蛋白抗體。二氨基聯(lián)苯胺顯色劑顯色后充分沖洗，HE復(fù)染，脫水，透明，封片。光鏡下每張切片選取5個(gè)視野，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0病理圖像分析軟件計(jì)算TLR4陽性表達(dá)的光密度平均值[累積光密度（IOD）/面積（Area）]。

逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）檢測(cè)TLR4表達(dá)：提取總的核糖核酸（RNA）后逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA），再用cDNA進(jìn)行多聚酶連反應(yīng)。反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，72℃延伸5 min，共40個(gè)循環(huán)。TLR4引物：上游引物： 5'-TCAGTGTGCTTGTGGTAG-3'，下游 引 物： 5'-TCTGCTAAGAAGGCGATAC-3'， 片段長度458 bp；β-actin引物的序列：上游引物5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，下游引物：5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，片段長度150 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物行1% 瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察、拍照及分析，且應(yīng)用Image J凝膠圖像分析處理系統(tǒng)計(jì)算目的片斷TLR4/β-actin條帶的OD比值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，偏態(tài)分布以中位數(shù)、四分位數(shù)間距表示。多組比較采用單因素方差分析，組間比較應(yīng)用SNK檢驗(yàn)。均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

生化指標(biāo)變化：糖尿病組和辛伐他汀組的空腹血糖均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；而前兩組間的空腹血糖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。糖尿病組、辛伐他汀組的甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平均明顯高于對(duì)照組，辛伐他汀組的甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平低于糖尿病組（P＜0.05）。三組大鼠的高密度脂蛋白膽固醇、肌酸激酶比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。表1

表1 大鼠生化指標(biāo)的變化（）

表1 大鼠生化指標(biāo)的變化（）

注：與對(duì)照組比較*P＜0.05，與糖尿病組比較△P＜0.05。肌酸激酶采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示

組別 例 空腹血糖(mmol/L)甘油三酯(mmol/L)總膽固醇(mmol/L)低密度脂蛋白膽固醇(mmol/L)高密度脂蛋白膽固醇(mmol/L) 肌酸激酶 (U/L)對(duì)照組 10 5.92±1.28 0.80±0.21 2.47±0.59 1.21±0.29 1.87±0.33 952 (623)糖尿病組 13 12.04±2.04* 1.86±0.22* 5.15±1.09* 2.13±0.17* 0.67±0.17* 1307(1430)辛伐他汀組 13 11.23±2.61* 1.13±0.27*△ 3.30±0.91*△ 1.67±0.33*△ 1.27±0.30 1375(741)

心肌形態(tài)學(xué)改變：對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，胞核似橢圓形或長方形，胞質(zhì)清晰，偶見炎細(xì)胞。糖尿病組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞明顯水腫,可見廣泛心肌纖維斷裂，間質(zhì)充血，大量炎細(xì)胞浸潤。辛伐他汀組的心肌改變較糖尿病組明顯減輕。圖1

圖1 三組大鼠心肌HE染色（×100）

心肌Toll受體4蛋白表達(dá)水平：心肌TLR4蛋白表達(dá)主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的棕黃色顆粒沉著。對(duì)照組大鼠心肌有少量表達(dá)，呈淺棕黃色；糖尿病組TLR4的蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，呈棕黃色；辛伐他汀組TLR4的表達(dá)較糖尿病組明顯減少，但仍多于對(duì)照組（圖2）。糖尿病組的IOD/Area （0.6157±0.0233）是對(duì)照組（0.3210±0.0151）的192%（P＜0.05）；辛伐他汀組IOD/Area（0.4302±0.0224）是糖尿病組的69.87%（P＜0.05），兩者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)法分析心肌TLR4 mRNA表達(dá)水平：心肌TLR4 mRNA的表達(dá)結(jié)果以rTLR4表示（rTLR4＝TLR4 OD值/β-actin OD值）。糖尿病組大鼠心臟rTLR4（1.43±0.16）是對(duì)照組（0.42±0.06）的341%（P＜0.05）；辛伐他汀組（0.73±0.13）是糖尿病組的51.05% （P＜0.05），兩者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖3。

圖2 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)大鼠心肌 Toll樣受體4蛋白表達(dá)（×200）

圖3 各組大鼠心臟心肌 Toll樣受體4 信使核糖核酸的表達(dá)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)復(fù)制2型糖尿病大鼠模型，HE染色示心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞水腫、變性，廣泛性心肌纖維斷裂，間質(zhì)充血，大量炎細(xì)胞浸潤等，說明糖尿病大鼠已經(jīng)出現(xiàn)心肌病變，但肌酸激酶水平與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，推測(cè)此時(shí)處于病變的早期，因此尚需延長實(shí)驗(yàn)時(shí)間以進(jìn)一步觀察。研究發(fā)現(xiàn)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中活化TLR4通過TLR/核因子-κ B（NF-κ B）信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)非耐受性炎癥反應(yīng)[4]。Reyna等[5]發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者肌肉組織中TLR4 mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)含量明顯升高，且其抑制蛋白-κB（IKB）／NF-κ B信號(hào)通路激活程度也增加。但國內(nèi)外對(duì)于TLR4與糖尿病性心肌病變之間關(guān)系的研究尚不多見，吳鏗等[6]發(fā)現(xiàn)TLR4與腫瘤壞死因子-α在糖尿病心肌灌注的炎性損傷中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)糖尿病大鼠HE染色顯示心肌發(fā)生了炎癥和損傷，免疫組織化學(xué)染色和RT-PCR結(jié)果顯示與正常對(duì)照組比較，糖尿病組TLR4的蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯升高，這說明TLR4可能參與了糖尿病心肌病變的發(fā)生、發(fā)展。

在糖尿病狀態(tài)下，TLR4的表達(dá)水平明顯升高，可能與下列因素有關(guān)：高血糖能激活蛋白激酶C和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶，從而誘導(dǎo)TLR4表達(dá)，進(jìn)而通過一系列反應(yīng)引起NF-κ B易位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，使心肌受損、細(xì)胞凋亡、血管內(nèi)皮重構(gòu)、心室肥厚及心臟功能障礙等[7]；2型糖尿病患者存在體重增加、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激增強(qiáng)等，這些可使TLR4內(nèi)源性配體熱休克蛋白60、游離脂肪酸、內(nèi)毒素等增多，從而激活TLR4-NF-κ B信號(hào)通路，致TLR4表達(dá)增加、細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)。TLR4的表達(dá)水平升高，又可促進(jìn)糖尿病心肌病變的發(fā)生發(fā)展[8]。TLR4與各種內(nèi)外源性配體結(jié)合后，可通過一系列蛋白質(zhì)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活NF-κ B抑制蛋白激酶（IKK），激活的IKK一方面通過絲氨酸磷酸化增加，減弱胰島素信號(hào)通路，最終產(chǎn)生胰島素抵抗；另一方面通過降解NF-κ B抑制因子a，從而調(diào)控炎性反應(yīng)因子的表達(dá)，從而間接導(dǎo)致胰島素抵抗[9]。通過上述兩種途徑導(dǎo)致胰島素抵抗，進(jìn)而加速心肌病變的發(fā)生發(fā)展?？傊赥LR4的參與下，各機(jī)制之間相互作用，共同參與糖尿病心肌病變的發(fā)生發(fā)展。

有研究表明，他汀類藥物能降低健康人及高膽固醇血癥患者外周血單核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)及其下游的信號(hào)分子[10-12]。Satoh等[13]發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可通過MicroRNA let-7i的表達(dá)下調(diào)冠狀動(dòng)脈疾病患者的TLR4信號(hào)，從而發(fā)揮抗炎作用。本實(shí)驗(yàn)中辛伐他汀組與糖尿病組相比，TLR4的蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯降低，且心肌細(xì)胞水腫、變性，心肌纖維斷裂，間質(zhì)充血，炎細(xì)胞浸潤等情況亦明顯減輕，說明辛伐他汀可能通過下調(diào)心臟TLR4 的表達(dá)而抑制TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，阻斷細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)的釋放，從而發(fā)揮對(duì)心肌病變的保護(hù)作用。但由于干預(yù)時(shí)間短且無陽性對(duì)照，因此尚需更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究去進(jìn)一步證實(shí)。

[1] Kleinman JC, Donahue RP, Harris MI, et al. Mortality among diabetes in a national sample. Am J Epidemiol, 1988, 128: 389-401.

[2] 奚苗苗, 文愛東, 梁欣, 等. 2型糖尿病大鼠模型的建立及其氧化應(yīng)激特征分析. 中國藥物與臨床, 2010, 10: 8-12.

[3] 錢燕, 李素梅, 葉山東, 等. 辛伐他汀對(duì)糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)作用及其抗炎機(jī)制探討. 中國新藥雜志, 2008, 17: 1212-1216.

[4] 王文蒙, 李剛, 羅俊卿, 等. 活化Toll樣受體4誘導(dǎo)靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)非耐受性炎癥反應(yīng).中國循環(huán)雜志, 2009, 24: 127-130.

[5] Reyna SM, Ghosh S, Tantiwong P, et al．Elevated Toll-like receptor-4 expression and signaling in muscle from insulin resistance subjects. Diabetes, 2008, 57: 2595-2602.

[6] 吳鏗, 游瓊, 莫海亮, 等. 糖尿病心肌病外周血單核細(xì)胞Toll樣受體4、腫瘤壞死因子-α的表達(dá)及其與心肌灌注的相關(guān)性. 中華心血管病雜志, 2011, 39: 503-507.

[7] Dasu MR, Jialal I. Free fatty acids in the presence of high glucose amplify monocyte inflammation via Toll-like receptors. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2011, 300: e145-e154.

[8] Dasu MR, Devaraj S, Zhao L, et al. High glucose induces toll-like receptor expression in human monocytes: mechanism of activation. Diabetes, 2008, 57: 3090-3098.

[9] 陳海英, 曲鵬, 安伶. Toll樣受體4與2型糖尿病及其并發(fā)癥. 國際內(nèi)分泌代謝雜志, 2010, 30: 248-251.

[10] 牛楠, 曲鵬, 徐丹, 等．阿托伐他汀降低急性冠脈綜合癥患者外周血CD14 單核細(xì)胞表面TLR4的表達(dá). 中華高血壓雜志, 2008, 16: 422-426.

[11] Methe H, Kim JO, Kolfer S, et al. Statin decrease To11-likereceptor4 expressionanddownstream signaling in human CD14 non-ocytes. Atrerioseler Thromb Vasc Biol, 2005, 25: 1439-1445.

[12] Hodgkinson CP, Ye S. Statins inhibit toll-like receptor 4-mediated lipopolysaccharide signaling and cytokine expression. Pharmacogenet Genomics, 2008, 18: 803-813.

[13] Satoh M, Shimoda Y, Maesawa C, et al. Activated toll-like receptor 4 in monocytes is associated with heart failure after acute myocardial infarction. Int J Cardiol, 2006, 109: 226-234.

Simvastatin Reducing the Expression of Myocardial Toll Like Receptor 4 in Type 2 Diabetic Rats

LV Sha-sha, LIU Kuan-zhi.

Department of Endocrinology, the Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang (050051), Hebei, China

LIU Kuan-zhi, Email: Liu-kuanzhi@163.com

Objective: To observe the effect of simvastatin on reducing the expression of myocardial Toll like receptor 4 (TLR4) in type 2 diabetic rats.Methods: A total of 40 male SD rats were divided into 2 groups, Control group, n=10, the rats had normal feed and Experimental group, n=30, the rats received hyperglycemia and hypelipaemia feed for 6 weeks. There were 26 experimental rats with fasting blood glucose ＞7.8 mmol/L def i ned as diabetic rats and divided into 2 groups, Diabetic group, the rats received the normal saline, and Simvastatin group, the rats received simvastatin 20mg/(kg.d) for 8 weeks. n=13 in each group. The myocardial tissue was examined by optical microscopy, TLR4 protein and mRNA expressions were measured by immuno histochemistry and RT-PCR respectively in different groups.Results: Compared with Control group, the myocardial tissue in Diabetic group showed obvious edema and inf l ammatory cell inf i ltration, those damages were much less in Simvastatin group. The immuno-histochemistry and RTPCR presented that TLR4 protein and mRNA expressions in Diabetic group (0.6157 ± 0.0233) and (1.43 ± 0.16) were signif i cantly higher than those in Control group (0.3210 ± 0.0151) and (0.42 ± 0.06) all P<0.05. The TLR4 protein and mRNA expressions in Simvastatin group (0.4302 ± 0.0224) and (0.73 ± 0.13) were lower than Diabetic group but higher than Control group, all P<0.05.Conclusion: Simvastatin may reduce the expressions of TLR4 protein and mRNA and decrease the inflammatory reaction therefore protect the cardiac tissue in experimental rats.

Toll like receptor 4; Simvastatin; Diabetic cardiopathy; Inf l ammatory reaction

2013-09-03）

（助理編輯：許菁）

050051 河北省石家莊市,河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 內(nèi)分泌1科

呂莎莎 碩士研究生 主要從事糖尿病與代謝性疾病的研究 Email: 413969935@qq.com 通訊作者：劉寬芝Email: Liu-kuanzhi@163.com

R54

A

1000-3614（2014）01-0064-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.01.017

方法：40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=10）和實(shí)驗(yàn)組（n=30）。其中對(duì)照組給予普通飼料，實(shí)驗(yàn)組用高糖高脂飼料喂養(yǎng)。6周后測(cè)定空腹血糖＞7.8 mmol/L且伴有胰島素敏感指數(shù)降低的大鼠作為2型糖尿病大鼠模型，共26只，將其隨機(jī)分為糖尿病組（n=13）和辛伐他汀組（n=13）。干預(yù)治療8周。留取心臟組織做光鏡觀察，分別采用免疫組織化學(xué)染色和逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）檢測(cè)各組大鼠心肌TLR4蛋白和信使核糖核酸（mRNA）的表達(dá)。

結(jié)果：與對(duì)照組比較，光鏡下可見糖尿病組心肌細(xì)胞明顯水腫，并可見大量炎細(xì)胞浸潤，辛伐他汀組心肌組織損傷較糖尿病組明顯減輕。免疫組織化學(xué)染色和RT-PCR顯示，糖尿病組大鼠TLR4蛋白和mRNA表達(dá)分別為0.6157±0.0233和1.43±0.16，明顯高于對(duì)照組（0.3210±0.0151和0.42±0.06，P＜0.05）；辛伐他汀組大鼠TLR4 蛋白和mRNA表達(dá)分別是0.4302±0.0224和0.73±0.13，低于糖尿病組（P＜0.05），但仍高于對(duì)照組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)論:辛伐他汀從蛋白和mRNA水平下調(diào)2型糖尿病大鼠心肌TLR4的表達(dá)、降低炎癥反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)心臟的保護(hù)作用。