周穎，陳游洲，喬樹賓

Apelin對血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞肥大的作用及其機制

周穎，陳游洲，喬樹賓

目的：探討Apelin對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ） 誘導的心肌細胞肥大的作用及其細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制。

血管緊張素Ⅱ；心肌細胞肥大；鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶；鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:733.)

心肌肥厚是各種心臟疾病的重要表現(xiàn)之一。引起心肌肥厚的因素很多，包括神經(jīng)體液因素、應力負荷等[1,2]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）中的血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）通過不同的信號轉(zhuǎn)導途徑誘導心肌肥厚[3]。在鈣依賴的信號通路中，AngⅡ通過延長動作電位, 使心肌細胞內(nèi)Ca2+水平升高，激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（Calcineurin）和鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）[4]，促進心肌肥厚的發(fā)展。

1993年，發(fā)現(xiàn)了一個結(jié)構(gòu)與血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）相似的蛋白，命名為血管緊張素1型受體相關蛋白（APJ）[5]，1998年從牛胃分泌物中提取了APJ內(nèi)源性配體，命名為Apelin[6]。Apelin與AngⅡ具有同源性，APJ與AT1R在疏水跨膜區(qū)也有40%～50%的同源性，是RAS的新成員[7]。研究表明，Apelin與AngⅡ在體內(nèi)，尤其在心血管系統(tǒng)影響著若干相同的生物過程，例如Apelin擴張血管，降低血壓；在慢性心室壓力超負荷所致的心肌肥厚模型中，Apelin mRNA明顯減少，而AngⅡmRNA明顯增加[8,9]；機械牽拉是引起心肌肥厚的因素之一，牽拉心肌細胞12 h或24 h后，心肌細胞的Apelin和APJ mRNA水平也顯著減少，與AngⅡ正好相反[10]。說明Apelin可能在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過程中起到與AngⅡ相反的作用。

本實驗以AngⅡ誘導SD大鼠乳鼠原代心肌細胞肥大，采用不同濃度Apelin進行干預，觀察Apelin能否拮抗AngⅡ誘導的心肌細胞肥大，并且進一步探討其細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制。

1 材料與方法

試驗材料：實驗動物：1～3 d 的SD乳鼠1只（維通利華實驗動物有限公司，中國）。試劑：Apelin-13（Sigma公司，美國），Ang Ⅱ（Sigma公司，美國），DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），胰蛋白酶（Sigma公司，美國），膠原酶Ⅱ（Invitrogen公司，美國），無鈣鎂PBS，胎牛血清（Gibco公司，美國），5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）、青霉素、鏈霉素、乙醇、鼠抗橫紋肌肌動蛋白單克隆抗體（Sigma-Aldrich公司，美國），[3H]-亮氨酸、閃爍液、閃爍瓶（Perkin Elmer公司，美國），心肌細胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）（碧云天生物技術研究所，江蘇，中國），一抗B型腦鈉肽（BNP）抗體、CaMKⅡ 抗體、p-CaMK Ⅱ抗體（Santa Cruz公司，美國）、β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）（Abacam and Alpha公司，美國）、Calcineurin抗體、p-Calcineurin抗體、活化T細胞的核因子3（NFATc3）抗體（BD公司，美國）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、β-actin抗體（全式金生物技術公司，中國），二抗（兔抗鼠IgG）（Invitrogen公司，美國）、Superscript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶 （Invitrogen公司，美國），SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TaKaRa公司，日本）。儀器：CO2培養(yǎng)箱（SANYO 17-AC，日本），倒置相差顯微鏡（Olympus BHl，日本），超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司，中國），熒光顯微鏡，酶標儀，高速低溫離心機，RT-PCR儀，液體閃爍儀（Tri-Carb 2900TR，美國）。

試驗方法：心肌細胞培養(yǎng)：取1～3 d SD乳鼠心室肌，用0.1%胰蛋白酶加0.04%膠原酶Ⅱ消化，差速貼壁1.5 h，將未貼壁的心肌細胞用含10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素DMEM培養(yǎng)液稀釋成1×108/L，并加入0.1 mmol/L Brdu抑制非心肌細胞增殖，接種于6孔培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。換用普通培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h。倒置相差顯微鏡鏡下觀察，24 h后90%的細胞都自發(fā)性搏動，頻率一致，約200次/分。

肌動蛋白單克隆抗體的免疫組化染色：將原代心肌細胞放入預先放置有載玻片的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)48 h后，取出載玻片，采用肌動蛋白單克隆抗體進行免疫組化染色，90%以上的細胞呈陽性染色，則繼續(xù)以下實驗。

實驗分組：SD乳鼠的心肌細胞換無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。Apelin及AngⅡ均由無菌過濾器過濾除菌后加入心肌細胞。實驗分組如下：①對照組：正常心肌細胞不加任何干預因素；② Apelin組：正常心肌細胞分別給予Apelin-13 10 nmol/L（10 nM亞組）、100 nmol/L（100 nM亞組）和1000 nmol/L（1000 nM亞組）；③AngⅡ組：心肌細胞給予AngⅡ 100 nmol/L，刺激心肌細胞肥大；④AngⅡ+Apelin組：心肌細胞給予AngⅡ 100 nmol/L，同時再分別給予Apelin-13 10 nmol/L[AngⅡ+A（10 nM）亞組]、100 nmol/L [AngⅡ+A（100 nM）亞組]和1000 nmol/ L[AngⅡ+Apelin（1000 nM）亞組]。每天加藥1次，每2天換液1次。

觀測指標：心肌細胞表面積測定：加藥后72 h，每孔隨機選擇5個視野攝片，每個視野再任取15個細胞，用美國Image-Proplus專業(yè)圖像分析軟件測定細胞表面積，取其平均值。

心肌細胞蛋白合成速率測定：心肌細胞加入各種干預因素和18.3 kBq[3H]-亮氨酸繼續(xù)培養(yǎng)72 h。棄培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3遍，用0.1%胰蛋白酶消化后收集細胞于玻璃纖維素膜上，用10%三氯乙酸固定，濾膜烘干后用液體閃爍儀測定摻入量。

心肌細胞蛋白的提取和總蛋白含量的測定：各組心肌細胞培養(yǎng)72 h后，終止細胞培養(yǎng)，用冰PBS收集貼壁心肌細胞，加入心肌細胞裂解液50 μl和苯甲基磺酰氟（PMSF）1 μl，冰上裂解30 min。4 000 g離心15 min，移上清于1 ml的EP管中。用二辛可酸（BCA）法測定心肌細胞樣品總蛋白含量[11]。

免疫印跡法測BNP、β-MHC和Calcineurin抗體、p-Calcineurin抗體、NFATc3、CaMK Ⅱ、p-CaMKⅡ的蛋白表達：每組取50 μl蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉后以一抗（1：2000）4℃孵育過夜，繼與辣根過氧化物酶標記抗體（1: 2000）37℃孵育1 h。常規(guī)洗膜，ECL顯色系統(tǒng)（Amersham）檢測，Ban&can圖像分析系統(tǒng)定量各蛋白條帶的總灰度值。

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）測BNP、β-MHC的mRNA表達：各組心肌細胞培養(yǎng)72 h后，終止細胞培養(yǎng)，1×106細胞經(jīng)PBS洗滌后用Trizol提取總RNA。取總RNA 4 μg，加入Oligo-(dt)18（0.5 μg/ μl）1 μl，再加入DEPC水，配成總體積為12 μl的反應體系，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實時熒光定量PCR擴增目的基因。引物由上海生工設計合成。

統(tǒng)計學處理：采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的分析處理。所有計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間差異只有兩組時用t檢驗，有多組時用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1Apelin對肥大心肌細胞的表面積、蛋白合成速率、總蛋白表達量的影響

在AngⅡ組，肥大心肌細胞給予AngⅡ（100 mmol/L）作用72 h后，可以使心肌細胞表面積、總蛋白表達量明顯增加，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在AngⅡ+Apelin組，不同濃度的Apelin與AngⅡ共同作用于心肌細胞72 h后，心肌細胞表面積、亮氨酸摻入量和總蛋白表達量與AngⅡ組相比明顯減少，呈Apelin劑量依賴性。在Apelin組，單獨以不同濃度Apelin作用于心肌細胞，以上指標與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。圖1

圖1 Apelin在體外可劑量依耐性地抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞肥大

2.2Apelin對心肌細胞肥大標志物的影響

在AngⅡ組，100 mmol/L的AngⅡ作用72 h后，心肌細胞BNP和β-MHC的mRNA和蛋白表達水平明顯升高，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在AngⅡ+Apelin組，Apelin與AngⅡ共同作用于心肌細胞時，隨著Apelin作用濃度的增加，BNP和β-MHC的mRNA和蛋白表達水平逐漸下降，呈劑量依賴性。在Apelin組，單獨以不同濃度的Apelin（10 mmol/L，100 mmol/L，1000 mmol/L）作用于心肌細胞，其BNP和β-MHC的mRNA和蛋白表達水平與對照組相比無顯著性差異。圖2

圖2 Apelin對心肌細胞肥大標志物的影響

2.3Apelin對心肌細胞內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶、活化的T細胞核因子3和鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ信號通路的影響

在AngII組，AngⅡ?qū)π募〖毎鸆alcineurin蛋白表達無明顯影響，但可明顯上調(diào)其磷酸化產(chǎn)物p-Calcineurin的蛋白表達水平，同時提高心肌細胞NFATc3的蛋白表達水平。同時，AngⅡ可明顯提高心肌細胞CAMK Ⅱ及其磷酸化產(chǎn)物p-CAMK Ⅱ的蛋白表達水平。在AngⅡ+Apelin組發(fā)現(xiàn)上述作用可被Apelin抑制，并呈劑量依賴性。在Apelin組，單獨以不同濃度的Apelin作用于心肌細胞，以上指標與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義。圖3

圖3 免疫印跡分析Apelin對心肌細胞內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶，活化的T細胞核因子3和鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ蛋白表達量的影響

3 討論

心肌肥厚是心血管疾病死亡率升高的一個獨立危險因素。循環(huán)中或心肌局部Ang Ⅱ是引起心肌細胞肥大的最重要的活性物質(zhì)之一[12]。Apelin擴張血管、降低血壓，與AngⅡ所致的縮血管效應相反[6]。我們假設Apelin能夠發(fā)揮與AngⅡ相反的作用，改善心肌肥厚，并進一步探討了Apelin在AngⅡ誘導的心肌細胞肥大中的作用機制。

Apelin在體內(nèi)分為Apelin-36，Apelin-13和Apelin-12[7]。本研究使用的是生物活性最強的Apelin-13。

本研究發(fā)現(xiàn)，當Apelin與AngⅡ聯(lián)合作用時，AngⅡ的促心肌細胞肥大作用顯著受到抑制。表現(xiàn)為心肌細胞表面積明顯減小，蛋白合成速率下降，總蛋白合成量減少，同時可使BNP和β-MHC的蛋白表達水平明顯下降。以上作用呈劑量依賴性。

研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ致心肌細胞肥大, 主要通過激活鈣依賴的信號通路，活化Calcineurin及其下游的活化的T細胞核因子，調(diào)節(jié)心臟肥大基因的表達[3，4]。通過轉(zhuǎn)基因的方法過表達Calcineurin或者NFAT可以誘導明顯的心肌肥厚[13]。阻斷NFATc3活性能逆轉(zhuǎn)心肌肥厚進程[14,15]。CaMKⅡ被激活后也可誘導肥大基因表達，促進心肌肥厚[4]。肥厚心肌中CaMKⅡ的表達增加[16]。阻斷CaMKⅡ可以抑制心肌肥厚[17]。預先給予Apelin可以抑制缺血再灌注損傷造成的心肌細胞內(nèi)鈣超載[18]。因此，我們假設Apelin可以通過Ca2+介導的Calcineurin和CaMKⅡ信號轉(zhuǎn)導通路，對抗AngⅡ誘導的心肌肥厚。

本研究首次探討了Apelin在肥大的心肌細胞中對Ca2+/calmodulin （CaM）依賴的Calcineurin和CaMKⅡ信號通路的影響。在本研究中，AngⅡ可明顯上調(diào)Calcineurin的磷酸化產(chǎn)物p-Calcineurin及其下游因子NFATc3，以及CaMKⅡ的蛋白表達水平，與心肌細胞肥大的趨勢一致。而Apelin可以明顯抑制AngII的促心肌細胞肥大作用，并呈劑量依賴性。因此推斷，Apelin可能通過Ca2+介導的Calcineurin-NFAT和CaMKⅡ信號通路，抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大?？尚羞M一步的研究探索Apelin的抗心肌肥厚的作用是否能被Calcineurin、NFATc3和/或CaMKⅡ的拮抗劑所抑制，明確Calcineurin-NFAT和CaMKⅡ信號通路在Apelin抗心肌肥厚作用中的作用。

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Effect of Apelin on Angiotensin II-induced Cardiomyocyte Hypertrophy With its Mechanism in Experimental Rats

ZHOU Ying, CHEN You-zhou, QIAO Shu-bin.
Department of Cardiology, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China

QIAO Shu-bin, Email: qsbfw@sina.com

Objective: To explore the effect of apelin on angiotensin II (Ang II)-induced cardiomyocyte hypertrophy and intracellular signal transduction mechanism in experimental rats.Methods: The cardiomyocyte from 1 to 3 days neonatal rats were cultured with Ang II to induce the cardiomyocyte hypertrophy, and the cells were treated by apelin at different concentrations. The [3H] Leucine incorporation, cardiomyocyte surface area and total protein expression were analyzed to evaluate the degree of cardiomycyte hypertrophy. The protein expressions of intracellular BNP, β-MHC, nuclear factor 3 of activated T cells (NFATc3), calcineurin, phospho-calcineurin, calmodulin kinase II (CaMK II) and phospho-CaMK II were assessed by Western blot analysis. The mRNA expressions of BNP and β-MHC were examined by RT-PCR.Results: Apelin may inhibit Ang II induced cardiomyocyte hypertrophic response in a dose-dependent manner, the maximum inhibition was achieved at Ang II 1000 nmol/L. Meanwhile, apelin may inhibit Ang II-induced elevations of intracellular resting free calcium level, mRNA expressions of BNP and β-MHC, protein expressions of NFATc3, phosphocalcineurin, CaMK II and phospho-CaMK II in a dose-dependent manner.Conclusion: Apelin may inhibit Ang II-induced cardiomyocyte hypertrophy in experimental rats which might be related to Ca2+-dependent calcineurin signal pass ways.

Angiotensin II; Cardiomyocyte hypertrophy; Calcineurin; Calmodulin kinase II

2014-05-05）

（助理編輯：許菁）

100037 北京市，北京協(xié)和醫(yī)學院 中國醫(yī)學科學院 國家心血管病中心 阜外心血管病醫(yī)院 冠心病診治中心

周穎 主治醫(yī)師 博士研究生 主要從事冠心病、心肌病等研究 Email: drzhouying@gmail.com 通訊作者: 喬樹賓 Email: qsbfw@sina.com

R363.16

A

1000-3614（2014）09-0733-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.09.019

方法：培養(yǎng)1～3 d新生Sprague-Dawley大鼠心肌細胞，給予AngⅡ刺激。在此基礎上給予不同濃度Apelin。測定[3H]亮氨酸摻入量、細胞表面積以及總蛋白表達量評價心肌細胞肥大程度。免疫印跡法測定細胞B型尿鈉肽、β肌球蛋白重鏈、活化T細胞的核因子3、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶、磷酸化鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶、鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ、磷酸化鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ的蛋白表達水平。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應法測定B型尿鈉肽和β肌球蛋白重鏈mRNA表達水平。

結(jié)果：Apelin可以抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大，其作用呈劑量依賴性。同時，Apelin可以抑制AngⅡ誘導的B型尿鈉肽和β肌球蛋白重鏈mRNA表達水平、B型尿鈉肽和β肌球蛋白重鏈、活化T細胞的核因子3、磷酸化鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶、鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ和磷酸化鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ的蛋白表達水平升高，且均與Apelin濃度呈劑量依賴性。

結(jié)論：Apelin可以抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大，其機制與Ca2+依賴的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號轉(zhuǎn)導通路有關。