燈盞花素在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)Hep G2 肝細(xì)胞TG含量的影響及機(jī)制探討＊

陽(yáng) 琰，高 琳△，鄧華聰，晏永慧，李顯文，王小英，廖 鑫，張 晗，陳其榮，王 茜

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科563003；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院400016）

高三酰甘油（hypertriglyceridemia，HTG）血癥在胰島素抵抗（insulin resistance，IR）相關(guān)性疾病如肥胖、2 型糖尿?。═2DM）、冠心病等的發(fā)展中起重要作用［1］。HTG血癥與T 2DM發(fā)病率增多有關(guān)。HTG 血癥是T2DM發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，以HTG為標(biāo)志的脂代謝異常常伴IR，其可能發(fā)生在糖代謝紊亂之前［2］。因此，HTG血癥的危害已經(jīng)引起內(nèi)分泌學(xué)者的高度重視。燈盞花素（breviscapine）是從菊科短亭飛蓬屬植物中提取出來(lái)的黃酮類有效成分，是燈盞乙素和少量甲素的混合物，其中燈盞乙素含量占95%以上，燈盞花素藥理活性廣泛，具有抗血小板、抗血栓等作用，被廣泛應(yīng)用于臨床治療，并具有降低TG的作用［3］，但其具體作用機(jī)制不清楚。目前發(fā)現(xiàn)TG與肝臟過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-α（peroxisome proliferator-activated receptor-alpha，PPAR-α）、載脂蛋白A5（apolipoprotein A5，apo A5）基因表達(dá)密切相關(guān)［4］，但燈盞花素降低TG是否也與PPAR-α、apo A5 基因表達(dá)有關(guān)，目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)觀察燈盞花素在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HepG2 肝細(xì)胞內(nèi)PPAR-α、apo A5 表達(dá)及三酰甘油含量的影響，旨在初步探討燈盞花素降低三酰甘油的可能機(jī)制，為進(jìn)一步探索燈盞花素調(diào)節(jié)TG 代謝的具體機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑HepG2 細(xì)胞購(gòu)于協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞庫(kù)。燈盞花素注射液購(gòu)于昆明龍津藥業(yè)股份有限公司。DMEM購(gòu)于Gibco-BRL 公司，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑 盒 購(gòu) 于Takara公 司。apoA5抗 體（ab36974）購(gòu) 于Santa Cruz 公司。二抗和細(xì)胞蛋白抽提試劑盒均購(gòu)于寶生物公司。三酰甘油測(cè)定試劑盒購(gòu)于北化康泰臨床試劑公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組Hep G2 細(xì)胞被培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶進(jìn)行消化，每2～3 天更換1 次培養(yǎng)基并進(jìn)行傳代。HepG2 肝細(xì)胞接種于6 孔板中，12h 后長(zhǎng)至融合度為80%左右，更換為無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，在濃度依賴實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取100 mmol／L 燈盞花素進(jìn)行時(shí)間依賴實(shí)驗(yàn)。加入100 mmol／L 燈盞花素，不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)（0、6、12、24、36、48 h），分別定義為：（1）0 h 組（空白對(duì)照）；（2）6h 組；（3）12h 組；（4）24 h 組；（5）36h 組；（6）48h 組；每組取3 個(gè)復(fù)孔，所測(cè)結(jié)果取3 孔平均值。

1.3 測(cè)定各組細(xì)胞apo A5 基因及TG含量PPAR-α引物正義：5′-ACT TAT CCT GTG GTC CCC GG-3′；反義：5′-CCG ACA GAA AGG CAC TTG-3′；apo A5引 物 正 義：5′-ACG CAC GCA TCC AGC AGA-3′；反 義：5′-TGA AAG ATT CGG AAA C-3′；GAPDH引物正義：5′-TAG TTG CGT TAC ACC CTT TCT-3′；反義：5′-TGC TGT CAC CTT CAC CG-3′。提取細(xì)胞總RNA，以總RNA 1.5μg 為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄總的反應(yīng)體積是20μL。反應(yīng)體系總體積為25 μL，sterile water 16.3μL，10 ×Taq buffer 2.5μL，引物1（10 μM）0.75μL，引物2（10μM）0.75μL，MgCl2（25 m M）1.5 μL，4d NTP（2.5 m M）2μL，cDNA 1μL，Taq酶5 U （0.2 μL）。條件：94℃5 min，94℃30 s，退火溫度30 s，72℃延長(zhǎng)20 s，循環(huán)34 次，72 ℃延長(zhǎng)10 min。按照TG試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作（酶法測(cè)定）。

1.4 測(cè)定各組細(xì)胞apo A5 蛋白表達(dá) 收集經(jīng)上述處理后的細(xì)胞，用BCA法定量測(cè)定各組細(xì)胞apo A5 蛋白表達(dá)水平。取30μL 蛋白質(zhì)加樣，經(jīng)12%PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，取apo A5一抗的稀釋度為1∶2000，二抗的稀釋度為1∶1000，堿性磷酸酶法顯色，曝光。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用±s表示，正態(tài)分布資料應(yīng)用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)資料的方差分析及其兩兩比較，分析各組細(xì)胞內(nèi)apo A5 基因、蛋白表達(dá)及TG含量的差異。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

在0～24 h之 內(nèi)，HepG2肝 細(xì) 胞 內(nèi)PPAR-α、apoA5基 因及蛋白表達(dá)水平隨著燈盞花素作用時(shí)間增加而增加，當(dāng)達(dá)到36 h 后HepG2 肝細(xì)胞內(nèi)PPAR-α、apoA5 基因及蛋白表達(dá)水平開(kāi)始下降，48 h下降最明顯，但均高于空白對(duì)照組（P＜0.05）；而肝細(xì)胞內(nèi)三酰甘油含量在0～24 h 之內(nèi)隨著燈盞花素作用時(shí)間增加反而降低，至24 h時(shí)降到最低（P＜0.05），36 h 后又開(kāi)始升高，48 h升高最明顯，但均低于空白對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1、2，圖1、2。

圖1 燈盞花素在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)Hep G2 肝細(xì)胞PPAR-α蛋白表達(dá)的影響

表1 燈盞花素在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HepG2肝細(xì)胞PPAR-α、apo A5 mRNA表達(dá)及TG的影響（±s）

表1 燈盞花素在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HepG2肝細(xì)胞PPAR-α、apo A5 mRNA表達(dá)及TG的影響（±s）

時(shí)間（h） PPAR-α apoA5 TG（mg／g）0（空白對(duì)照）0.823±0.1130.0027±0.00031228.8±144.261.323±0.153＊＃ 0.0051±0.0008＊＃ 849.3±104.4＊＃123.132±0.421＊＃ 0.0069±0.0011＊＃ 628.2±85.1＊＃

續(xù)表1 燈盞花素在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)Hep G2肝細(xì)胞PPAR-α、apo A5 m RNA表 達(dá) 及TG的 影 響（±s）

續(xù)表1 燈盞花素在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)Hep G2肝細(xì)胞PPAR-α、apo A5 m RNA表 達(dá) 及TG的 影 響（±s）

時(shí)間（h） PPAR-α apoA5 TG（mg／g）244.357±0.075＊＃ 0.0121±0.0018＊＃ 422.2±67.2＊＃361.631±0.023＊＃ 0.0059±0.0010＊＃ 712.3±77.4＊＃481.172±0.014＊＃ 0.0042±0.0006＊＃ 952.3±94.1＊＃

圖2 燈盞花素在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)Hep G2 肝細(xì)胞apo A5 蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

2011年歐洲心臟病學(xué)會(huì)（ESC）和歐洲動(dòng)脈粥樣硬化學(xué)會(huì)（EAS）聯(lián)合發(fā)布的血脂異常管理指南明確指出，TG在脂毒性危害中占據(jù)非常重要的地位。肝臟是三酰甘油代謝的重要器官，高三酰甘油血癥是糖尿病發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)和特征［5］。肝臟中有許多調(diào)控三酰甘油代謝的基因表達(dá)，其中apo A5 基 因 與TG、IR、代 謝 綜 合 征 密 切 相 關(guān)［6-7］，因 此，從apo A5 基因出發(fā)進(jìn)行研究，可能對(duì)于闡明T2DM、HTG血癥的發(fā)生、發(fā)展有非常重要的意義。

在臨床治療中，多數(shù)糖尿病患者均具有高TG血癥，在進(jìn)行降糖治療過(guò)程中，應(yīng)積極考慮降脂治療，但傳統(tǒng)降脂藥物可能驅(qū)使血脂更集中于肝臟進(jìn)行代謝，反而促使脂質(zhì)貯積并損害肝功能［8］，尤其對(duì)于糖尿病合并脂肪肝的患者極為不利。近年研究表明燈盞花素的藥理作用非常廣泛，被廣泛應(yīng)用于臨床治療，其療效肯定，除擴(kuò)張微血管、降低血液黏稠度、改善微循環(huán)外，還具有降低血脂，尤其是TG，并對(duì)糖尿病性肝臟損害有一定的治療和保護(hù)作用［9］，但其具體作用機(jī)制仍不清楚。因此，本研究通過(guò)觀察燈盞花素在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)人HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量的影響，旨在初步探討燈盞花素降低肝臟內(nèi)TG的機(jī)制，可能為防治糖尿病性脂肪肝提供一點(diǎn)新的思路和靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0～24 h 隨著燈盞花素作用時(shí)間的增加，Hep G2 肝細(xì)胞內(nèi)PPAR-α、apoA5 基因、蛋白表達(dá)水平也隨之增加，當(dāng)達(dá)到36 h 后又開(kāi)始下降，48h 下降最明顯，但均高于空白對(duì)照組（P＜0.05）；而肝細(xì)胞內(nèi)TG含量在0～24 h 隨著燈盞花素作用時(shí)間增加而降低，至24 h 時(shí)TG含量降到最低（P＜0.05），36 h 后又開(kāi)始上升，48h 升高最明顯，但均低于空白對(duì)照組（P＜0.05）。由此可推測(cè)，燈盞花素能降低肝臟TG含量，并具有時(shí)間依賴性，其機(jī)制可能是通過(guò)增加PPAR-α的表達(dá)，進(jìn)而增加apo A5 表達(dá)從而使TG含量降低，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究探索。

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