王大星，謝 彤△，茅乃權(quán)，左傳田，朱 波，潘 琪，王守峰

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院：1.胸外科；2.檢驗(yàn)科，南寧530021）

肺癌在早期并無(wú)特異的典型癥狀，75%的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者就診時(shí)已屬晚期，錯(cuò)過(guò)了手術(shù)機(jī)會(huì)，因此化學(xué)治療成為主要的治療手段，然而肺癌的多藥耐藥一直是導(dǎo)致化學(xué)治療失敗的主要原因。越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生的始動(dòng)細(xì)胞［1-3］，并且是腫瘤多藥耐藥的主要原因［4］。ATP-binding cassette（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的跨膜蛋白是引起這種多藥耐藥的最重要因素，而ABCG2 作為腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志基因以及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)超家族的重要成員［5-7］，受到了人們的廣泛關(guān)注。本研究通過(guò)測(cè)定NSCLC患者化學(xué)治療前后血清中ABCG2 水平的變化，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 試驗(yàn)組血清取自本院化學(xué)治療2 科2009年7月至2010年9月NSCLC 化學(xué)治療患者，共50例，入選患者均經(jīng)病理確診，以往未經(jīng)任何治療。50例患者中，男35例，女15例；年齡39～77 歲，中位年齡60 歲。組織學(xué)分型：腺癌20例，鱗癌15例，其他15例（其中大細(xì)胞癌3例，類癌2例以及病理類型不明確的低分化癌10例）。TNM分期：Ⅲ期18例（其中Ⅲa期4例，Ⅲb期14例），Ⅳ期32例（其中M1a10例，M1b 22例）。所有患者均使用含鉑兩藥方案（GP方案：順鉑75 mg／m2，第1 天；吉西他濱1000mg／m2，第1、8 天。TP 方案：順鉑75 mg／m2，第1 天；多西他賽75mg／m2，第1 天）化學(xué)治療2 周期以上。對(duì)照組血清取自與實(shí)驗(yàn)組同時(shí)間段的15例健康者，其中男9例，女6例；年齡31～59 歲，中位年齡46 歲。

1.2 方法

1.2.1 療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 化學(xué)治療2 周期后評(píng)價(jià)療效，治療前后行病灶部位CT斷層掃描，療效評(píng)價(jià)按RECIST實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)方法判定［8］，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩(wěn)定（SD）和進(jìn)展（PD），將CR＋PR判定為化學(xué)治療有效，SD＋PD為化學(xué)治療無(wú)效。

1.2.2 主要試劑和儀器ABCG2 酶聯(lián)免疫分析試劑盒，美國(guó)cusabio公司產(chǎn)品。The rmoMu l t i skanMK3酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo 公司產(chǎn)品。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法 采集所有受檢者清晨空腹靜脈血5 m L，放置2 h 后離心取上層血清，置于-80℃保存?；颊哐悍謩e于化學(xué)治療前、化學(xué)治療2 個(gè)周期后各抽取1 次。按說(shuō)明書操作，用ELISA方法檢測(cè)血清中ABCG2 的水平。以標(biāo)準(zhǔn)物的水平為橫坐標(biāo)（正常坐標(biāo)），光密度（OD）值為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)）作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)得的血清OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，試驗(yàn)組患者與對(duì)照組、不同分期、患者化學(xué)治療前后血清ABCG2水平比較以及血清ABCG2 水平與化學(xué)治療療效關(guān)系的比較采用t檢驗(yàn)；有無(wú)胸水與化學(xué)治療療效關(guān)系的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照組與試驗(yàn)組患者化學(xué)治療前血清ABCG2 水平的比較 試驗(yàn)組患者化學(xué)治療前血清ABCG2水平為（223.3±7.2）ng／m L，明顯高于對(duì)照組的（97.3±7.8）ng／m L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 不同分期試驗(yàn)組患者血清ABCG2 水平的比較 Ⅲ期患者血清ABCG2水平為（227.5±6.9）ng／m L，Ⅳ期患者血清ABCG2 水平為（220.3±7.5）ng／m L，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 試驗(yàn)組患者化學(xué)治療前后血清ABCG2 水平的比較 試驗(yàn)組患者化學(xué)治療前血清ABCG2水平為（223.3±7.2）ng／m L，化學(xué)治療后血清ABCG2 水平為（253.0±7.4）ng／m L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 血清ABCG2 水平與化學(xué)治療療效的關(guān)系 化學(xué)治療有效的患者，化學(xué)治療前后血清ABCG2 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；化學(xué)治療無(wú)效的患者，化學(xué)治療后血清ABCG2 水平較化學(xué)治療前升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)組化學(xué)治療有效者與無(wú)效者血清ABCG2水平的比較（±s，ng／mL）

表1 試驗(yàn)組化學(xué)治療有效者與無(wú)效者血清ABCG2水平的比較（±s，ng／mL）

組別 n 化學(xué)治療前 化學(xué)治療后t P有效16201.8±9.4204.5±8.20.5070.619無(wú)效34233.4±9.2275.7±7.47.3330.000

2.5 血清ABCG2 水平與胸水的關(guān)系 有胸水患者化學(xué)治療有效率（12.5%，1／8）低于無(wú)胸水患者（35.7%，15／42），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。有胸水患者化學(xué)治療前血清ABCG2 水平（246.0±9.2）ng／mL 高于無(wú)胸水患者（219.0±8.3）ng／m L，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

2004年Goodell 等［9］報(bào)道經(jīng)流式細(xì)胞儀分選的 弱染Hoechst33342 的小鼠骨髓細(xì)胞具有造血干細(xì)胞的特點(diǎn)。用這種方法分選出來(lái)的細(xì)胞稱為SP 細(xì)胞，一般認(rèn)為側(cè)群細(xì)胞富集了干細(xì)胞。而多藥耐藥基因ABCG2 則是決定不同組織來(lái)源SP細(xì)胞排出Hoechst33342 特性的成因［10］。ABCG2 也因此逐漸成為分離干細(xì)胞的候選標(biāo)志。ABCG2 基因是1998年從耐藥的乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的耐藥基因［11］，它能夠借助ATP 水解的能量，將細(xì)胞內(nèi)的多種藥物分子主動(dòng)地“泵”到細(xì)胞外，使腫瘤細(xì)胞內(nèi)毒性藥物的水平降低而逃避多種藥物的殺傷作用［11］。Hirshmann-Jax 等［12］研究發(fā)現(xiàn)只有部分腫瘤細(xì)胞具有SP表型，表達(dá)ABCG2，腫瘤非SP 細(xì)胞對(duì)常用的抗癌藥物敏感性要大于SP細(xì)胞，表明ABCG2 的表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物敏感性下降的直接原因。謝彤等［13］成功分選出人肺腺癌A-549 細(xì)胞系SP細(xì)胞亞群，并發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞亞群對(duì)多種化學(xué)治療藥物的敏感性以及細(xì)胞內(nèi)化學(xué)治療藥物的水平均顯著低于非SP細(xì)胞，提示ABCG2 可能在介導(dǎo)上述化學(xué)治療藥物排出細(xì)胞外的過(guò)程中起著重要作用，由于外排化學(xué)治療藥物能力增強(qiáng)，直接導(dǎo)致了SP 細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療的耐受性。ABCG2 也分布于正常組織中，在健康者的血清中亦有表達(dá)［14］。目前少見(jiàn)有關(guān)ABCG2 在NSCLC 患者血清中水平的研究報(bào)道。作者之前的研究對(duì)NSCLC 患者手術(shù)前后血清中ABCG2 的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，患者術(shù)后血清中ABCG2明顯下降，且與健康者無(wú)明顯差異，說(shuō)明ABCG2 的表達(dá)與腫瘤病灶的存在有關(guān)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清ABCG2 水平明顯高于健康者，這與胡毅等［16］的研究相符。腫瘤耐藥模式有天生耐藥和獲得性耐藥，前者是由于腫瘤干細(xì)胞通常處于靜止期、有較強(qiáng)的DNA修復(fù)能力、表達(dá)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族蛋白而獲得的。而后者則是基于正常干細(xì)胞積累突變的同樣機(jī)制，由于長(zhǎng)期暴露于輻射以及致癌物后，干細(xì)胞及其相近的子代細(xì)胞通過(guò)點(diǎn)突變、基因激活、基因擴(kuò)增等而出現(xiàn)新的耐藥性［4］。本研究對(duì)試驗(yàn)組患者化學(xué)治療前后血清ABCG2 水平變化進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)化學(xué)治療后血清ABCG2 水平升高，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。究其原因，可能是化學(xué)治療藥物引起了腫瘤干細(xì)胞上ABCG2基因的突變，從而導(dǎo)致其過(guò)表達(dá)；ABCG2 基因的變化直接影響到癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的外排能力，從而改變了患者對(duì)藥物的敏感性；也可能是化學(xué)治療殺死了腫瘤非干細(xì)胞，因而表達(dá)ABCG2 的腫瘤干細(xì)胞比例增多，血清中的ABCG2 蛋白水平也因而升高。李德龍等［17］的研究也發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞系經(jīng)5-FU作用后肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物EpCAM、ABCG2、ICAM-1陽(yáng)性細(xì)胞和G0／G1期細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯增加，表明應(yīng)用5-FU的確可以富集肝癌干細(xì)胞。這種富集作用是由于肝癌干細(xì)胞逃逸化學(xué)治療藥物的殺傷實(shí)現(xiàn)的。

亞組分析顯示，化學(xué)治療有效者血清ABCG2 水平較化學(xué)治療前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但化學(xué)治療無(wú)效者化學(xué)治療后血清ABCG2 水平則明顯高于化學(xué)治療前（P＜0.05）；化學(xué)治療無(wú)效者血清ABCG2 水平無(wú)論化學(xué)治療前及化學(xué)治療后均較化學(xué)治療有效者高。換言之，血清ABCG2 水平高者化學(xué)治療療效差。這一結(jié)果提示血清ABCG2水平可能可以作為化學(xué)治療療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，有胸水患者化學(xué)治療前血清ABCG2 水平有高于無(wú)胸水患者的趨勢(shì)；而有胸水患者化學(xué)治療有效率為12.5%（1／8），無(wú)胸水患者化學(xué) 治療有效率則為35.7%（15／42），盡管差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但前者化學(xué)治療有效率亦有低于后者的趨勢(shì)，符合血清ABCG2 水平高者化學(xué)治療療效差這一結(jié)論。

［1］ Al-Hajj M，Wicha MS，Benito-Hernandez A，et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100（7）：3983-3988.

［2］ Singh SK，Hawkins C，Clarke ID，et al.Identification of human brain tumour initiating cells［J］.Nature，2004，432（715）：396-401.

［3］ Kondo T，Setoguchi T，Taga T.Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（3）：781-786.

［4］ Dean M，F(xiàn)ojo T，Bates S.Tumour stem cells and drug resistance［J］.Nat Rev Cancer，2005，5（4）：275-284.

［5］ Robey RW，Polgar O，Deeken J，et al.ABCG2：determining its relevance in clinical drug resistance［J］.Cancer Metastasis Rev，2007，26（1）：39-57.

［6］ Ap áti A，Orb án TI，Varga N，et al.High level functional expression of the ABCG2 multidrug transporter in undifferentiated human embryonic stem cells［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1778（12）：2700-2709.

［7］ Polgar O，Robey RW，Bates SE.ABCG2：structure，function and role in drug response［J］.Expert Opin Drug Metab Toxicol，2008，4（1）：1-15.

［8］ Therasse P，Arbuck AG，Eisenhauer EA，et al.New guidelines to evaluate to the responds of treatment in solid tumer［J］.J Natl Cancer Inst，2000，92（3）：205-216.

［9］ Goodell MA，Brose K，Paradis G，et al.Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo［J］.J Exp Med，1996，183（4）：1797-1806.

［10］ Zhou S，Schuetz JD，Bunting KD，et al.The ABC transporter Bcrp1／ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype［J］.Nat Med，2001，7（9）：1028-1034.

［11］ Doyle LA，Yang W，Abruzzo LV，et al.A multidrug resistance transporter from human MCF27 breast cancer cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1998，95（26）：15665-15670.

［12］ Hirschmann-Jax C，F(xiàn)oster AE，Wulf GG，et al.A distinct“side population”of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（39）：14228-14233.

［13］ 謝彤，李力，黎丹戎，等.人肺腺癌A549 細(xì)胞系干細(xì)胞相關(guān)亞群的分離與鑒定［J］.中華腫瘤雜志，2011，33（2）：84-90.

［14］ Doyle LA，Ross DD.Multidrug resistance mediated by the breast cancer resistance protein BCRP（ABCG2）［J］.Oncogene，2003，22（47）：7340-7358.

［15］ 王大星，謝彤.手術(shù)前后NSCLC血清ABCG2表達(dá)水平的變化及臨床意義［J］.中國(guó)癌癥防治雜志，2011，3（1）：56-58.

［16］ 胡毅，馮奉儀，程書鈞，等.NSCLC患者血清中乳腺癌耐藥蛋白的表達(dá)及與化學(xué)療法療效的關(guān)系［J］.中華腫瘤雜志，2006，28（10）：750-752.

［17］ 李德龍，朱雯靜，韓旭，等.肝癌干細(xì)胞逃避5-氟尿嘧啶單藥殺傷可能是造成化學(xué)療法失敗的重要原因［J］.實(shí)用肝臟病雜志，2012，15（2）：126-129.