張 超

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250355）

HPLC法測(cè)定市售蒺藜飲片中3種黃酮苷元的含量

張 超

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250355）

目的建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定蒺藜飲片中槲皮素、山柰素和異鼠李素含量的方法。方法用Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，甲醇－0.1%甲酸溶液（47∶53）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)368 nm，流速1.0 mL·min－1，柱溫25℃。結(jié)果槲皮素、山柰素和異鼠李素分別在0.58～29.0、0.292～14.6、0.248～12.4μg·mL－1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r＞0.999 7），平均回收率分別為100.91%、99.44%、99.20%，RSD分別為1.91%、1.85%、1.73%。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確度高，可為蒺藜飲片的質(zhì)量控制和炮制研究提供參考依據(jù)。

蒺藜；槲皮素；山柰素；異鼠李素；高效液相色譜法

蒺藜為蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果實(shí)，具有平肝解郁，活血祛風(fēng)，明目，止癢的功效。歷版藥典均有收載，《中國(guó)藥典》2010年版（一部）對(duì)蒺藜藥材和飲片的質(zhì)量控制僅有性狀、鑒別、檢查項(xiàng)，還未有相關(guān)指標(biāo)成分的含量測(cè)定項(xiàng)。蒺藜主要含有甾體皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、生物堿、多糖等化合物［1］，其中，黃酮類(lèi)主要是以槲皮素、山柰素、異鼠李素為苷元的黃酮苷類(lèi)化合物，已有蒺藜藥材水解產(chǎn)物黃酮苷元含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道［2，3］，但目前市售蒺藜飲片多為炒制，還未見(jiàn)相關(guān)炒蒺藜中黃酮苷元含量測(cè)定的報(bào)道。本研究建立了HPLC同時(shí)測(cè)定蒺藜飲片中槲皮素、山柰素和異鼠李素含量的方法，為控制蒺藜炮制品的質(zhì)量，探討蒺藜的炮制意義奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100 Series型高效液相色譜儀：G1312A二元泵、G1315B紫外檢測(cè)器、G1316A柱溫箱（美國(guó)安捷倫科技公司）；KQ－250E型醫(yī)用超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；十萬(wàn)分之一電子分析天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試藥 甲醇、乙腈均為色譜純，水為高純水，其他試劑為分析純。槲皮素、山柰素和異鼠李素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為：100081－200406、110861－200405、110860－200406，供含量測(cè)定用）。所購(gòu)5批蒺藜飲片經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)周鳳琴教授鑒定為蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果實(shí)，分別取100 g粉碎，過(guò)三號(hào)篩，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18（4.6 mm× 250 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇－0.1%甲酸溶液（47∶53）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)368 nm；進(jìn)樣量20μL。槲皮素、山柰素和異鼠李素分離度良好，無(wú)其他雜質(zhì)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱(chēng)取槲皮素對(duì)照品7.25 mg，山柰素對(duì)照品3.65 mg，異鼠李素對(duì)照品3.10 mg，置同一50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 取蒺藜樣品1.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇－25%鹽酸（4∶1）的混合溶液25 mL，密塞，稱(chēng)定重量，沸水浴中加熱回流1 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取混合對(duì)照品溶液0.1、0.4、1.6、3.2 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。再分別精密量取以上稀釋溶液和原混合對(duì)照品溶液各1.0 mL，用甲醇稀釋定容至5 mL。各進(jìn)樣20μL測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果槲皮素在0.58～29.0μg·mL－1之間呈較好的線性關(guān)系（Y＝219.55X＋2.044，r＝0.999 7），山柰素在0.292～14.6μg·mL－1之間呈較好的線性關(guān)系（Y＝262.85X－1.638，r＝0.999 8），異鼠李素在0.248～12.4μg·mL－1之間呈較好的線性關(guān)系（Y＝614.17X＋3.103，r＝0.999 7）。

2.5 精密度試驗(yàn) 吸取“2.4”項(xiàng)下一稀釋混合對(duì)照品溶液（槲皮素2.32μg·mL－1，山柰素1.168μg ·mL－1，異鼠李素0.992μg·mL－1），重復(fù)測(cè)定5次，結(jié)果槲皮素、山柰素和異鼠李素的精密度均較好（RSD分別為0.76%、0.73%和0.85%）。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一蒺藜供試品溶液，分別于0，2，4，8，12 h測(cè)定，結(jié)果槲皮素、山柰素和異鼠李素在12 h內(nèi)的穩(wěn)定性較好（RSD分別為1.04%、0.92%和1.21%）。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取5號(hào)樣品粉末1.0 g，精密稱(chēng)定，共5份，照“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按確定的含量測(cè)定方法測(cè)定槲皮素、山柰素和異鼠李素的含量，結(jié)果重復(fù)性好，變異系數(shù)小，符合含量測(cè)定要求（RSD分別為1.29%、0.98%和1.35%）。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 取已測(cè)定含量的5號(hào)樣品約0.5 g，精密稱(chēng)定，共5份，加入5 mL槲皮素、山柰素和異鼠李素混合對(duì)照品溶液（分別精密稱(chēng)取槲皮素對(duì)照品2.17 mg置10 mL量瓶，山柰素對(duì)照品1.80 mg置50 mL量瓶，異鼠李素對(duì)照品2.00 mg置50 mL量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再分別精密量取以上3種對(duì)照品溶液1.0 mL稀釋定容至同一50 mL量瓶中，即得）。再精密加入甲醇－25%鹽酸（4∶1）的混合溶液20 mL，按確定方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1～3。

表1 槲皮素回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 山柰素回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 異鼠李素回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量測(cè)定 分別取5批蒺藜樣品1.0 g各3份，精密稱(chēng)定，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法及“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，并計(jì)算各樣品中槲皮素、山柰素和異鼠李素含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 蒺藜樣品測(cè)定結(jié)果（n＝3）

3 討論

本研究所用5批蒺藜均為炒制品，是目前常用炮制品，亦是常見(jiàn)的市售品。樣品測(cè)定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道［2，3］均有不同程度下降，這是否與炒制相關(guān)，有待進(jìn)一步確定。

安捷倫高效液相色譜儀二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)槲皮素、山柰素和異鼠李素對(duì)照品發(fā)現(xiàn)3者最大吸收波長(zhǎng)分別為：槲皮素（256 nm，368 nm），山柰素（265 nm，366 nm），異鼠李素（254 nm，370 nm），因此檢測(cè)波長(zhǎng)定為368 nm。

在供試品溶液制備方法的研究中，曾比較甲醇和無(wú)水乙醇提取的差異，兩者未見(jiàn)顯著差異，還對(duì)沸水浴回流時(shí)間進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)1 h時(shí)黃酮苷元量已達(dá)平臺(tái)。流動(dòng)相選擇僅對(duì)甲醇－0.1%甲酸溶液洗脫比例進(jìn)行了調(diào)整以實(shí)現(xiàn)更好的分離效果。本研究所確定蒺藜飲片水解黃酮苷元HPLC測(cè)定方法，與傳統(tǒng)總黃酮UV測(cè)定法［4］相比，簡(jiǎn)便易行，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度均較好，可用于蒺藜飲片的質(zhì)量控制。

［1］李瑞海.中藥蒺藜活性成分及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究［D］.沈陽(yáng)：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2006：10－14.

［2］師勤，余伯陽(yáng).反相高效液相色譜法測(cè)定蒺藜類(lèi)3種水解黃酮苷元的含量［J］.藥物分析雜志，1999，19（2）：75－78.

［3］郝艷玲.HPLC法測(cè)定蒺藜中總黃酮的含量［J］.實(shí)用藥物與臨床，2006，9（5）：276－278.

［4］吳瓊詩(shī).蒺藜全草中總黃酮的含量測(cè)定［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，14（4）：273－275.

表3 3批樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg·g－1）

3 討論

3.1 在提取條件比較時(shí)，采用本法直接加溶劑超聲提取與《中國(guó)藥典》2010年版（一部）［5］“三七”［含量測(cè)定］項(xiàng)先溶劑浸泡過(guò)夜再加熱回流提取兩法比較，兩法提取效果沒(méi)有顯著差異，而本文采用的方法更簡(jiǎn)便、快捷。

3.2 本文建立的方法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、重復(fù)性好、測(cè)定準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能同時(shí)測(cè)定三七的3種主要活性成分，可以作為疏血通脈膠囊重要的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。

參考文獻(xiàn)：

［1］劉泰，韋必清，韋玉進(jìn).醒腦通脈膠囊對(duì)腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2005，32（2）：89－91.

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［3］劉泰，譚璐璐，秦若飛，等.醒腦通脈膠囊對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠TNF－a的影響［J］.廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，10（4）：13－16.

［4］姚曦，何偉，李勇，等.HPLC法測(cè)定復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1、Rb1的含量［J］.中國(guó)藥房，2011，22（15）：1398－1400.

［5］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：11.

Determ ination of three flavonoid aglycones in Fructus tribuli by HPLC

ZHANG Chao
（Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China）

ObjectiveTo establish a HPLCmethod for the determination of the content of quercetin，kaempferol and isorhamnetin in Fructus tribuli.MethodsKromasil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）column was used to analyze three flavonoid aglycones contentwith methanol－0.1%methanoic acid aqueous solution（47∶53）as mobile phases.The flow rate was 1.0 mL·min－1.The detection wavelength was set at368 nm.ResultsThe linearity of each standard was established in the concentration range of0.58～29.0μg·mL－1for quercetin，0.292～14.6μg·mL－1for kaempferol，0.248～12.4 μg·mL－1for isorhamnetin，with correlation coefficient r＞0.999 7.The average recoveries（n＝5）of three flavonoid aglyconeswas 100.91%，99.46%，99.20%with the RSD of 1.91%，1.85%，1.73%，respectively.ConclusionThemethod was rapid，simple and accurate，which can be used in the quality control in Fructus tribuli.

Fructus tribuli；quercetin；kaempferol；isorhamnetin；HPLC

R927.2

：A

2095－5375（2014）03－0139－003

中醫(yī)藥行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目－20種中藥飲片炮制技術(shù)規(guī)范研究（No.201207004－9）

張超，男，博士研究生，副教授，研究方向：中藥新藥研究，E－mail：zhangchaotcm＠126.com