HPLC法測定勐?？h曬青毛茶兒茶素單體含量的研究

蔡 麗，梁名志，夏麗飛，楊盛美，李曉霞，陳 枚，李友勇，冉隆珣

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，云南 勐海 666201；2.云南省茶樹種質(zhì)資源創(chuàng)新與配套栽培技術(shù)工程研究中心，云南 勐海 666201）

勐?？h地處高原山區(qū)，海拔高低相差極大，地貌類型多樣，氣候類型復(fù)雜，氣溫垂直落差異常顯著，其自然條件非常適宜茶樹生長，且大部分茶園為天然生態(tài)茶園。不同地區(qū)所產(chǎn)的曬青毛茶在品質(zhì)上差異較大，而曬青毛茶是普洱茶的主要原料，它的好壞決定了普洱茶品質(zhì)的優(yōu)劣[1-4]。兒茶素是茶葉中最主要的生物活性成分之一，占茶葉干重的12%~24%；主要包括沒食子酸（GA）、表沒食子兒茶素（EGC）、右旋兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）等成分[5-6]。

試驗(yàn)采用高效液相色譜法對勐?？h普洱茶主要產(chǎn)區(qū)的曬青毛茶兒茶素單體進(jìn)行測定，以期揭示不同地區(qū)所產(chǎn)曬青毛茶中兒茶素單體成分及含量的差異，為構(gòu)建茶葉指紋圖譜提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試茶葉樣品為2010年春季在勐?？h10個(gè)主要產(chǎn)茶鄉(xiāng)鎮(zhèn)按一芽一葉標(biāo)準(zhǔn)采摘15個(gè)古樹茶樣和10個(gè)生態(tài)茶樣；試驗(yàn)主要試劑有兒茶素類化合物標(biāo)樣（美國SIGM A公司）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙酸（色譜純）等；試驗(yàn)主要儀器有超純水儀（Millipore公司）、分析天平（Denver公司）、水浴鍋（北京精瑞科技有限公司）、離心機(jī)（Beckman公司）、高效液相色譜儀（Waters公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 曬青毛茶樣品的前處理 高溫殺青曬干，每個(gè)茶樣得干茶樣約300 g備用。工藝流程為鮮葉→攤青→殺青→曬干→磨樣→分析。準(zhǔn)確稱取茶粉1.000 0 g，加入80%（V/V，下同）甲醇100 m L，于30℃水浴中超聲提取20 m in，經(jīng)濾紙過濾，洗滌濾渣3次后合并濾液，定容至200 m L，用0.45 μm濾膜過濾后備用[7]。茶樣由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶葉加工與檢測中心分析檢測。

1.2.2 混合標(biāo)樣的配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取6種兒茶素類化合物的固體標(biāo)樣各10 mg，用50%的甲醇水溶液溶解并定容至10 m L，則6種兒茶素類化合物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度均為1 mg/m L。

1.2.3 色譜檢測條件 采用GB/T8313-2008中的方法進(jìn)行檢測。流動(dòng)相：A為甲醇，B為乙腈；流動(dòng)相的梯度為從10%的乙腈到 60%的乙腈，流速1 m L/m in，在36 m in內(nèi)完成；色譜柱為waters-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；檢測波長280 nm。每次檢測完成后，系統(tǒng)平衡15 m in后重復(fù)3次進(jìn)樣。所得數(shù)據(jù)用Empower軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖1中看出，在試驗(yàn)設(shè)置的色譜條件下，各種單體物質(zhì)的分離度較高，峰形較好。這說明該色譜條件符合試驗(yàn)要求。其中，Caf為咖啡堿，雖然其不是兒茶素類，但卻是茶葉的主要內(nèi)含物質(zhì)；EGC的保留時(shí)間為11.4 m in，圖1中未有明顯峰形，是因?yàn)槠湓诓枞~中含量較少，為了突出其他幾種兒茶素單體的峰形，特用Empower軟件對標(biāo)樣色譜圖進(jìn)行了處理。

2.2 勐海縣曬青毛茶兒茶素單體HPLC指紋圖譜

由表1可知，各鄉(xiāng)鎮(zhèn)曬青毛茶的兒茶素單體成分的含量差異顯著。其中，布朗山鄉(xiāng)老班章古樹茶的沒食子酸（GA）和右旋兒茶素（C）的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他鄉(xiāng)鎮(zhèn)茶葉的含量，而表沒食子兒茶素（EGC）和表兒茶素（EC）的含量卻稍低于其他鄉(xiāng)鎮(zhèn)茶葉的含量；而EGC、EC、EGCE、ECG含量最高的分別是西定鄉(xiāng)曼佤村委會(huì)賀松村古樹茶、格朗和鄉(xiāng)蘇湖村生態(tài)茶、勐往鄉(xiāng)曼糯大寨古樹茶、格朗和鄉(xiāng)帕沙村古樹茶。

由表2可知，各茶葉樣品的出峰時(shí)間及出峰順序均較穩(wěn)定，各種兒茶素單體在勐?？h產(chǎn)茶區(qū)的古樹茶和生態(tài)茶中的含量差異顯著。其中，EGC、C和EC的總變異數(shù)超過30%，這在同地區(qū)茶葉化學(xué)成分檢測上是比較罕見的現(xiàn)象，值得進(jìn)一步研究。

表1 茶葉樣品中6種兒茶素類化合物的含量 （%）Tab le 1 Content of six kinds of catechin compounds in tea sam ple

3 討 論

試驗(yàn)結(jié)果表明：勐?？h各鄉(xiāng)鎮(zhèn)曬青毛茶中兒茶素單體成分的含量差異顯著。這從理論上解釋了勐海各茶區(qū)茶葉感官差異顯著的主要原因，也為勐海縣曬青毛茶的指紋圖譜建立提供了理論依據(jù)。在HPLC檢測過程中，兒茶素單體成分均有穩(wěn)定的出峰時(shí)間和峰面積，因此兒茶素單體成分及含量可作為勐?？h曬青毛茶HPLC指紋圖譜的特征峰，用于鑒定茶葉的來源和品質(zhì)，有望成為勐海曬青毛茶的化學(xué)條碼，這在茶葉的質(zhì)量監(jiān)督和生化成分檢測中具有重要意義。根據(jù)25種曬青毛茶的兒茶素單體成分含量不同，可制定全縣各鄉(xiāng)鎮(zhèn)茶葉開發(fā)計(jì)劃，有針對性地開發(fā)利用特有的茶樹資源，為實(shí)現(xiàn)勐?？h“中國茶葉第一縣”的目標(biāo)提供指導(dǎo)。

表2 古樹茶與生態(tài)茶兒茶素單體成分統(tǒng)計(jì)分析Table 2 The statistical analysis of catechin monom er com positions in old-p lan and ecological tea （%）

茶葉中各種成分含量是相輔相成、互相影響的，對茶葉品質(zhì)起著決定性的。HPLC指紋圖譜的識(shí)別技術(shù)與模型構(gòu)建是茶葉鑒定的關(guān)鍵步驟，也是目前學(xué)者關(guān)注較多的研究領(lǐng)域[8]。由于茶葉成分絕大多數(shù)可在液相色譜上進(jìn)行檢測分析，且具備分離效能好、選擇性強(qiáng)、檢測靈敏度高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣以及可用作實(shí)驗(yàn)室小量制備等優(yōu)點(diǎn)，使得液相色譜法成為茶葉指紋圖譜技術(shù)的首選方法[9-12]。目前，茶葉的指紋圖譜研究的普及力度遠(yuǎn)不及中藥材的指紋圖譜研究，但是隨著茶葉消費(fèi)水平以及人們對自身健康關(guān)注度的不斷提高，茶葉品質(zhì)評(píng)價(jià)體系有待于進(jìn)一步科學(xué)化、合理化。在這一過程中，指紋圖譜研究必然將發(fā)揮其重要作用。

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