抗雞傳染性法氏囊病病毒單鏈抗體庫的構(gòu)建及其中和抗體的篩選

周 兵，李天鶴，李 寧，徐黎明，郭 茉，馬 蕾，張瑛杰，葉賢龍，趙景壯，衣春霖，韓曉輝，丁良君，李德山*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院/生物制藥教研室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.中國科學院大學 生命科學學院，北京 100049；3.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局 專利審查協(xié)作北京中心，北京 100083；4.中國水產(chǎn)科學研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070)

傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由IBD 病毒(IBDV)引起的雞和火雞的一種急性高度接觸性傳染病。該病主要侵害3 周齡～6 周齡雞，以損害法氏囊中的淋巴細胞為特征[1]。除直接引起雞死亡與生產(chǎn)性能下降外，還可以增加感染雞對其他病原體的易感性以及引起雞對疫苗免疫應答能力的下降[2]。VP2 既是IBDV 的主要結(jié)構(gòu)蛋白，又是病毒的主要宿主保護性抗原，與病毒中和抗體的誘導、抗原和毒力的變異、細胞凋亡等有關(guān)[3]。疫苗接種是預防IBD 的主要方法，近年來由于超強毒株(vvIBDV)的出現(xiàn)，使得IBD 的防制面臨新的困難。高免血清和卵黃抗體對IBD 具有良好的預防和治療效果，但由于成本和安全性等原因其應用受到限制。而基因工程重組抗體作為高親和性、以蛋白為基礎的靶向診斷和治療用生物制品，在病毒性疾病防制方面越來越受到重視。

本實驗通過構(gòu)建抗IBDV 細菌展示單鏈抗體(scFv)庫并表達了抗IBDV 的scFv，采用ELISA 和體外中和試驗對純化后的抗體進行活性鑒定，獲得了具有中和活性的抗IBDV 的scFv，為今后開發(fā)出療效更好的治療藥物奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 DF1 細胞、pET-27b(+)載體、E.coli DH5α 及Rosetta 株由本實驗室保存；含有(Gly4Ser)3linker 的克隆載體pTlinker 及含有NlpA 的細菌表面展示載體pBSD 由本實驗室構(gòu)建；VP2、FITC 標記的VP2 及IBDV B87 疫苗免疫雞陽性血清由本實驗室制備；免疫雞法氏囊由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；不同IBDV 株購自不同的生物公司；pMD18-T 載體及DNA Marker 購自TaKaRa 公司；HRP 標記的兔抗雞IgG(IgG-HRP)購自eBioscience 公司；蛋白分子量標準購自Fermentas公司；TRIzol 購自Invitrogen 公司；M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega 公司；AKTA Purifier 100 蛋白層析系統(tǒng)和HiLoad 16/60 Superdex75 pg 柱子購自GE 公司。引物由Invitrogen 公司合成(表1)。

1.2 雞法氏囊RNA的提取和cDNA的合成 取抗體效價為1∶32 000 的雞法氏囊組織約100 mg，采用TRIzol 試劑方法提取其總RNA。通過M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。

表1 目的片段擴增引物Table 1 Primers used in the amplification of the target gene

1.3 細菌展示sc Fv庫的構(gòu)建 以合成的cDNA 為模板，以P1/P2 和P3/P4 引物，分別擴增VH 和VL基因。通過Hin dⅢ/NheⅠ和Bam HⅠ/XhoⅠ酶切位點，分別插入到含有(Gly4Ser)3linker 的克隆載體pTlinker 中。利用SfiⅠ酶切割分離VH-linker-VL 片段與SfiⅠ酶切的細菌展示載體pBSD 相連，電轉(zhuǎn)化于DH5α 菌株中構(gòu)建成細菌展示scFv 庫。

1.4 細菌展示sc Fv庫的流式細胞儀篩選 將scFv庫的所有單菌落以培養(yǎng)基稀釋，37 ℃培養(yǎng)至OD600nm值約為0.4，經(jīng)0.25 mmol/L IPTG 37 ℃誘導4 h。收集2 mL 培養(yǎng)物，12 000 r/min 1 min。菌體沉淀用1 mL PBS 溶液重懸洗滌3 次，以350 μL 蔗糖(0.75 mmol/L)/Tris(0.1 mol/L)緩沖液重懸，加入35 μL 溶菌酶(10 mg/mL)，逐滴加入700 μL EDTA(1 mmol/L)，振蕩混勻，冰上孵育15 min 后加入50 μL MgCl2(0.5 mol/L)溶液，冰上孵育10 min，4 ℃12 000 r/min 離心1 min。原生質(zhì)球沉淀用PBS洗滌，重懸。同時依次加入10 μL 1 % BSA 和2 μL FITC 標記的 VP2(2 mg/mL)，冰上孵育1 h，12 000 r/min 離心1 min。沉淀用PBS 洗滌，PBS 重懸，采用流式細胞術(shù)(FCM)于488 nm 波長激光下檢測其熒光強度并分選。同時設置陰性對照(未與FITC 標記的VP2 孵育的原生質(zhì)球)。將分選出來的細菌進行重組質(zhì)粒的提取，并電轉(zhuǎn)化至DH5α 中，按上述方法進行第2 輪、第3 輪篩選，將篩選后提取的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至DH5α 中，挑取單菌落，擴培后按上述方法處理，逐個采用FCM 進行檢測，選出親和力比陰性對照強的克隆，進行測序并分析。

1.5 抗IBDV sc Fv基因的克隆及重組表達 采用引物P5/P6，以陽性重組質(zhì)粒pBSD-IBDV-scFv 為模板PCR 擴增scFv 基因，膠回收后用NcoⅠ和Hin dⅢ進行雙酶切，連接pET-27b(+)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-IBDV-scFv，經(jīng)測序正確后轉(zhuǎn)化Rosetta。重組菌經(jīng)終濃度為0.25 mmol/L 的IPTG，37 ℃誘導培養(yǎng)4 h。收集菌體經(jīng)超聲破碎后離心，分別取上清液和沉淀，進行SDS-PAGE 電泳分析。

1.6 包涵體的純化 誘導后菌體離心棄上清液，超聲破碎，離心，收集包涵體，洗滌后用溶解緩沖液(8 mol/L 尿素，pH8.0)充分溶解。使用AKTA Purifier 100 蛋白層析系統(tǒng)，進行包涵體蛋白純化復性，將蛋白于PBS 中過夜透析。進行SDS-PAGE 電泳分析，對其純度進行分析。并利用紫外分光光度計(ND-1000 型)檢測其濃度。

1.7 ELISA檢測重組sc Fv的親和力和特異性 將抗IBDV 的scFv 以濃度梯度400 μg/mL、80 μg/mL、16 μg/mL 和3.2 μg/mL 各100 μL 包被96 孔板檢測scFvs 對VP2 的結(jié)合能力；將濃度為400 μg/mL 的scFv 包被96 孔板檢測scFv 對不同IBDV 株(1-65株、MB 株、BJ836 株、NF8 株、Gt 株和B87 株)的結(jié)合能力。設置了只加底物的PBS 組作為背景對照，同時設置了未加VP2 蛋白或IBDV 的陰性對照1，未加高免血清的陰性對照2，未加VP2 蛋白或IBDV 和高免血清的陰性對照3，以及用BSA 或NDV 代替VP2 蛋白或IBDV 的陰性對照4。樣品及對照均設置了3 個平行孔。4 ℃包被過夜。采用5 %脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，加入VP2 蛋白(40 μg/mL)或不同IBDV 株(100 μL)，37 ℃1 h，以IBDV 高免血清為一抗(1∶200)，兔抗雞IgG-HRP 為二抗(1∶7 500)，以TMB 底物液避光顯色5 min，終止顯色反應后，酶標儀測定OD450nm值。

1.8 IBDV滴度的測定 將雞IBDV 疫苗(B87 株，200 μL)接種9 日齡雞胚，2 d～3 d 后收獲尿囊液。重復上述操作兩次，獲得活力較高的IBDV。待DF1 細胞培養(yǎng)至單層時將IBDV 10 倍倍比稀釋(10-1～10-11)，加于96 孔板中，對照組加DMEM，實驗組和對照組各8 個復孔，于37 ℃5%CO2培養(yǎng)。逐日觀察細胞病變(CPE)并記錄結(jié)果，觀察5 d～7 d。根據(jù)Reed-Muench 方法計算TCID50。

1.9 重組sc Fv中和活性的測定 將scFv 按2 倍倍比稀釋(400 μg/mL～0.781 μg/mL)，分別與100 TCID50的IBDV 混合，37 ℃孵育1 h?；旌弦悍謩e加到鋪有單層DF1 細胞的96 孔板中，對照組1 加DMEM，對照組2 加100 TCID50的IBDV，實驗組和對照組各8個復孔，于37 ℃5 % CO2培養(yǎng)。逐日觀察CPE 并記錄結(jié)果，觀察5 d～7 d。

2 結(jié)果

2.1 細菌展示sc Fv庫的構(gòu)建 以合成cDNA 第一條鏈為模板，以P1/P2 和P3/P4 為引物分別擴增VH和VL，膠回收產(chǎn)物分別插入到含有(Gly4Ser)3linker的克隆載體pTlinker 中。利用SfiⅠ對scFv 片段和pBSD 載體酶切，分別膠回收后連接并電轉(zhuǎn)化至DH5α 中，構(gòu)建細菌展示scFv 庫(圖1)。測定自制感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率為2.4×109。

圖1 細菌展示scFv 庫的構(gòu)建Fig.1 Construction of pBSD-scFv library

2.2 細菌展示sc Fv庫的篩選 將含有pBSD-scFv的陽性菌誘導表達后制備原生質(zhì)球，應用FCM 進行分析和分選，第一輪篩選P2 門內(nèi)5 %的細菌，共經(jīng)3 輪篩選，挑取單菌落進行FCM 檢測，挑選熒光信號比陰性高的克隆，篩選出5 株親和力較高的克隆，分別命名為S1，S2，S3，S4 和S5(圖2、圖3)。測序結(jié)果進行比對分析，結(jié)果表明均為雞源抗體，并且5 株克隆氨基酸同源性為82.16%～87.27%。

2.3 抗IBDV scFv表達及純化 對重組質(zhì)粒pETIBDV-scFv 進行PCR 以及Nco Ⅰ/Hin d Ⅲ雙酶切鑒定，結(jié)果與預期相符(745 bp)。重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明抗IBDV scFv 基因正確，并正確構(gòu)建了原核表達載體。

重組菌經(jīng)IPTG 誘導表達后將破碎后的菌體上清液和沉淀分別進行SDS-PAGE 分析，結(jié)果表明目的蛋白主要以包涵體形式表達。SDS-PAGE 分析表明，抗IBDV scFv 蛋白的分子量均約為28 ku，與預期結(jié)果相符(圖4)。

對包涵體進行變性和復性。將復性后蛋白透析后進行SDS-PAGE 分析，出現(xiàn)一條約28 ku 的目的蛋白條帶(圖4)。高效液相色譜分析結(jié)果表明5 個scFv 純度為85 %～90 %。

圖2 scFv 庫的流式細胞儀篩選Fig.2 Screening of scFv library by FCM

圖3 挑取的5 株克隆經(jīng)流式細胞儀進行親和能力檢測Fig.3 Affinity detection of scFvs by FCM

圖4 scFv 蛋白純化后的SDS-PAGE 電泳分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified scFv protein

2.4 ELISA檢測重組sc Fv與VP2蛋白和不同IBDV株的特異性結(jié)合能力 使用本實驗室表達純化的VP2 蛋白和不同IBDV 株對抗IBDV scFv 進行ELISA 檢測。ELISA 結(jié)果表明，反應數(shù)值隨scFv 濃度梯度的增加呈現(xiàn)上升趨勢，并且平行性好，數(shù)據(jù)經(jīng)T-Text 統(tǒng)計得出樣品的p 值與PBS 組以及相應的陰性對照1、2、3、4 組差異極顯著(p<0.01)。結(jié)果表明scFv 對VP2 蛋白和不同IBDV 株均具有特異性結(jié)合能力，并且不同scFv 對不同IBDV 株特異性結(jié)合能力不同(圖5、圖6)。

2.5 重組scFv中和活性的測定 將連續(xù)2 倍倍比稀釋的5 株scFv 與100 TCID50(TCID50=10-8.2/0.1 mL)的IBDV(B87 株)混合孵育，進行中和活性測定，結(jié)果顯示，S1 對100 TCID50的IBDV(B87 株)具有較高的中和活性，其100%的中和效價為1∶256(表2)。

圖5 ELISA 檢測scFv 和VP2 蛋白的特異性和親和力Fig.5 Specificity and affinity of scFv to VP2 detected by ELISA

圖6 ELISA 檢測scFv 和不同IBDV 株的特異性和親和力Fig.6 Specificity and affinity of scFv to different virus strains detected by ELISA

表2 scFv 抗IBDV(B87 株)中和活性的檢測Table 2 Neutralization tests of the scFv antibodies against IBDV(B87 strain)

3 討論

IBD 是對養(yǎng)禽業(yè)影響最大、造成經(jīng)濟損失最嚴重的傳染病之一，對IBD 疫苗的研制、開發(fā)和應用均值得探討的?；蚬こ炭贵w由于其高專一性、高親和力、高效性和高可塑性被廣泛應用于疾病的臨床診斷、預防、治療及基礎理論研究等領(lǐng)域[4]。目前篩選抗體庫的方法主要有噬菌體展示技術(shù)、酵母展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、細菌展示技術(shù)等。酵母展示技術(shù)庫容量偏低[5]，核糖體展示方法技術(shù)要求高，條件相對苛刻。細菌內(nèi)膜展示技術(shù)通過NlpA信號肽將抗體片段錨定在細菌內(nèi)膜的外側(cè)，周質(zhì)空間的氧化型環(huán)境和伴侶因子有利于抗體分子二硫鍵的正確形成，為抗體的表達提供了一個良好的微環(huán)境[6]，而且細菌顆粒較大，抗原和抗體結(jié)合后可以應用FCM 觀察和分選[7]，通過抗原和抗體的結(jié)合，能夠直觀的反應抗原和抗體的親和力，根據(jù)需要篩選不同親和力的抗體表達菌株，提高了篩選效率。此外，該技術(shù)相對簡便易行，只要經(jīng)過相應的酶切位點就可以直接將抗體的相應片段插入到展示載體中，利用細菌電轉(zhuǎn)化技術(shù)便可以獲得相對較高庫容(109～1010)的抗體庫。

單鏈抗體作為一種新型的基因工程抗體，具有很多的優(yōu)點：分子量小、穿透力強、半衰期短、免疫原性低，容易穿透組織，不易對身體產(chǎn)生不利影響；無Fc 段，不與具有Fc 受體的非靶細胞結(jié)合，其用于免疫診斷時成像清楚，本底低；易于大量生產(chǎn)。此外，scFv 為單個單順反子，對表達載體的要求相對較低，因此表達載體的構(gòu)建相對簡單易行。使其今后可能發(fā)展為治療疾病的有效藥物。

本研究首次獲得了抗IBDV 的本動物源抗體，經(jīng)ELISA 方法檢測，證明其對IBDV 具有特異性結(jié)合能力，經(jīng)體外細胞活性檢測，證明該scFv 可以有效阻斷IBDV 對DF1 細胞的侵染作用，從而進一步證明所獲得的scFv 具有中和活性，為研制治療IBD的抗體藥物奠定基礎。

[1]Kibenge F S B,Dhillon A S,Russell R G.Biochemistry and immunology of infectious bursal disease virus[J].J Gen Virol,1988,69(8):1757-1775.

[2]Calnek B W.禽病學(10 版)[M].高福，蘇敬良.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999：914-937.

[3]曾祥偉，王笑梅，高宏雷，等.傳染性法氏囊病超強Gx 株的致弱研究[J].中國預防獸醫(yī)學報，2003，25(2)：140-144.

[4]田輝，白福良，徐黎明，等.錯配PCR 技術(shù)提高抗hIL17A單鏈抗體親和力的研究[J].細胞與分子免疫學雜志，2012，28(7)：722-725.

[5]李月紅，張國力，岳玉環(huán)，等.細胞黏附分子1(ICAM-1)ScFv 基因原核載體的構(gòu)建及表達[J].中國獸醫(yī)學報，2012，32(5)：725-727.

[6]尹惠瓊.單鏈抗體的研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2003，24(2)：4-26.

[7]Wright A,Shin S U,Morrison S L.Genetically engineered antibodies:progress and prospects[J].Crit Rev Immunol,1992,12(3-4):125-168.