范桂芝

云南省昭通市畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣站，云南昭通 657000

蛋白質(zhì)是動(dòng)物新陳代謝、生長(zhǎng)繁殖等生理活動(dòng)必不可少的一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是動(dòng)物重要的營(yíng)養(yǎng)源之一，對(duì)于體組織、器官和細(xì)胞的形成、修補(bǔ)、增生，胎兒的形成，以及酶類和激素功能的實(shí)現(xiàn)都是不可缺少的；其作用是其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不可替代的；其成本占飼料成本的45%左右。粗蛋白是飼料營(yíng)養(yǎng)成分中的一個(gè)主要營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)，也是評(píng)價(jià)飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一，是飼料中含氮物質(zhì)的總稱，包括純蛋白質(zhì)和氨化物（非蛋白質(zhì)含氮物質(zhì)，如氨基酸、尿素等）。因此，飼料粗蛋白測(cè)定在飼料檢測(cè)中占據(jù)了非常重要的位置。目前生產(chǎn)中常用的檢測(cè)飼料粗蛋白的方法有國(guó)標(biāo)法、凱氏定氮法、強(qiáng)堿直接蒸餾法、雙氧水法、雙縮脲法等。其中，在使用國(guó)標(biāo)法測(cè)定飼料粗蛋白時(shí)，由于操作方法和實(shí)驗(yàn)儀器的原因，樣本經(jīng)消化、蒸餾、滴定諸道工序，易產(chǎn)生誤差。本文以GB/T6432-1994為準(zhǔn)，總結(jié)在多年的飼料粗蛋白檢測(cè)操作實(shí)踐中積累的經(jīng)驗(yàn)，參閱相關(guān)資料，提出了飼料粗蛋白測(cè)定應(yīng)注意的四個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，供大家參考。

1 樣品稱取

飼料粗蛋白測(cè)定的稱樣與其他項(xiàng)目測(cè)定稱樣有所不同，其他項(xiàng)目測(cè)定可直接稱樣，而粗蛋白測(cè)定的稱樣由于凱氏定氮管（即消化管）較長(zhǎng)，只能采取減量稱樣法。

即首先要在天平托盤(pán)上放一稱樣皿，再將需要取的樣品放入稱樣皿中，然后將天平除零后采用減量法取樣。

1.1 取樣過(guò)程注重細(xì)節(jié)

為保證稱樣準(zhǔn)確，在取樣過(guò)程中要注意細(xì)節(jié)。例如，取出樣品時(shí)應(yīng)該讓樣品緊貼樣品勺，避免取出的樣品灑落。每稱完一個(gè)樣品后，都應(yīng)該用定量濾紙擦拭干凈取樣勺，以免影響下一個(gè)樣品取樣。

取樣時(shí)應(yīng)使用干燥的消化管，潮濕的消化管容易弄潮取樣勺，既可能帶出剛放入的樣品，又可能影響下一次樣品取樣，導(dǎo)致取樣不準(zhǔn)確。另外，取樣時(shí)最好使用比較輕巧的長(zhǎng)把取樣勺將樣品直接送到消化管底部。最后，取出的樣品放入消化管時(shí)，盡可能不沾管壁，以免造成樣品消化不完全。

1.2 試樣用量要準(zhǔn)確

試樣的用量可根據(jù)具體情況而定，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定為0.5～1.0 g。該用量是針對(duì)濃縮料、配合飼料、魚(yú)粉、豆粕等蛋白含量較高的樣品而定的，但對(duì)于蛋白含量比較低的樣品，如稻谷、玉米等可適當(dāng)增加到2～3 g，否則，滴定時(shí)鹽酸的消耗量只有1～2 mL，會(huì)增加讀數(shù)和測(cè)定的誤差。

2 樣液消化

2.1 催化劑的選擇

樣品消化前需加入硫酸銅-硫酸鉀（或硫酸鈉）混合催化劑，其目的是提高消化溫度。除硫酸銅外，常用的催化劑還有汞、氧化汞、硒粉、還原鐵或上述物質(zhì)的混合物。催化劑的選擇要根據(jù)樣品的特性而定，對(duì)于一般的配合飼料樣品、濃縮飼料樣品等的消化，用硫酸銅作催化劑（在蒸餾氨時(shí)可作為堿性反應(yīng)的指示劑），使用強(qiáng)熱源即可；對(duì)于難消化物質(zhì)的樣品，硫酸銅催化效果不如汞，測(cè)得粗蛋白質(zhì)含量偏低；對(duì)于富含脂肪或消化過(guò)程中易發(fā)泡的樣品，可在消化前添加少量氧化劑，如過(guò)氧化氫。添加氧化劑可幫助有機(jī)質(zhì)消化，一般不用高錳酸鉀和次氯酸作氧化劑，因?yàn)檠趸暂^強(qiáng)的氧化劑會(huì)使氨氧化為氮?dú)舛鴵p失。

2.2 催化劑的用量

混合催化劑的用量稍多一點(diǎn)不影響檢測(cè)結(jié)果，但若過(guò)多（即硫酸鉀的用量過(guò)大），會(huì)導(dǎo)致消化溫度太高。這樣，在消化過(guò)程中，隨著硫酸的分解和水分的蒸發(fā)，硫酸鉀的濃度將逐漸增大，會(huì)加速有機(jī)物的分解，生成的硫酸銨會(huì)分解出氨而使測(cè)定結(jié)果偏低。另外，消化液加水后，樣液容易凝結(jié)成固體，蒸餾時(shí)需較長(zhǎng)時(shí)間溶解，稍不注意，蒸餾不徹底會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏低。

2.3 硫酸的用量

硫酸的用量，要根據(jù)樣品的取樣量來(lái)確定，如果取2～3 g樣，則需25 mL硫酸。對(duì)于含鹽量高的樣品，如某些劣質(zhì)魚(yú)粉、肉骨粉之類，需相應(yīng)增加硫酸用量，因?yàn)镹aCl+H2SO4→HCl↑，加熱后HCl會(huì)揮發(fā)。

樣品與催化劑混勻后再加入純硫酸，加硫酸的同時(shí)應(yīng)不斷搖晃消化管底部，盡量使樣品、催化劑和硫酸充分混溶，以免消化時(shí)燒焦未溶樣品而影響檢測(cè)結(jié)果。

2.4 消化火力的控制

樣液消化時(shí)按國(guó)標(biāo)GB/T6432-1994仲裁法要求是開(kāi)始使用小火，待泡沫消失、樣液焦化后再升溫至380～410℃。但筆者通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小火同樣會(huì)使樣液膨脹沾于消化管壁，因?yàn)闇囟鹊?，形成的蒸汽回流不足以使沾于管壁的樣液回流到管底，即使手工振搖消化管也很難將管壁上的樣液全部回流到管底，而且這種逐步升溫的方法需要時(shí)間較長(zhǎng)，待樣液變藍(lán)綠色需要2～3 h。而使用國(guó)標(biāo)GB/T6432-1994推薦法，一次性設(shè)置溫度至420℃，只需半小時(shí)左右即可使樣液變藍(lán)綠色，而且樣液回流較徹底，偶有個(gè)別發(fā)生沾壁，手工回流大多能辦到。但如果樣品用量大，硫酸用量相應(yīng)增加，樣液就多，消化時(shí)則需要適當(dāng)控制溫度。通過(guò)反復(fù)的試驗(yàn)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，一次性設(shè)置溫度至400℃左右的方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果并無(wú)影響。

在此需特別提醒，無(wú)論采用何種方法消化樣液，手工回流時(shí)必須注意安全，不能劇烈搖晃，更不能用水沖洗管壁（切忌）；搖晃時(shí)要將管口朝向無(wú)人處，以免燙傷自己或他人。如出現(xiàn)固體物無(wú)法回流的，該樣品必須重做，否則將會(huì)因消化不徹底而不同程度影響檢測(cè)結(jié)果。

3 消化液的蒸餾

蒸餾是將硫酸消化過(guò)的樣液加入足夠的強(qiáng)堿，在加熱的情況下生成氨氣，同時(shí)用足夠的硼酸將氨氣吸收的過(guò)程。蒸餾過(guò)程的操作較復(fù)雜，特別對(duì)于初學(xué)者來(lái)說(shuō)應(yīng)特別注意以下幾點(diǎn)。

3.1 空蒸及蒸餾檢驗(yàn)

在空蒸前必需先打開(kāi)冷凝水?？照羰怯每障芟日麴s10 min，目的是清洗管路和檢查蒸餾器各管路是否密閉及蒸餾功能是否正常，特別要注意蒸餾管接口是否緊密，否則產(chǎn)生的氨氣逸出將直接影響檢測(cè)結(jié)果。必要時(shí)需進(jìn)行蒸餾步驟的檢驗(yàn)，即準(zhǔn)確稱取0.2 g硫酸銨代替試樣，按蒸餾樣液時(shí)的步驟進(jìn)行操作，測(cè)得硫酸銨含氮量應(yīng)為21.19%±0.20%，否則應(yīng)檢查加堿、蒸餾和滴定各步驟是否正確。

3.2 蒸餾樣液

檢查空蒸正常后，打開(kāi)排廢液閥才能插接盛有樣液的蒸餾管，否則會(huì)發(fā)生回吸現(xiàn)象，管內(nèi)氣壓會(huì)將大量樣液壓入廢液管內(nèi)，導(dǎo)致該樣品檢測(cè)徹底失敗。開(kāi)始蒸餾的同時(shí)必須關(guān)閉排廢液閥，否則氨氣會(huì)從廢液管逸出，直接影響檢測(cè)結(jié)果。

3.3 調(diào)整電流

蒸餾時(shí)電流應(yīng)穩(wěn)定在4～5 A，如距此范圍不大，通過(guò)鍋爐加水閥調(diào)整即可。

如電流過(guò)高，會(huì)使樣液上沖噴入其他管道，造成樣液損失而影響檢測(cè)結(jié)果。可在蒸餾的同時(shí)打開(kāi)鍋爐排水閥，待電流降至4～5 A后，關(guān)閉鍋爐排水閥，再通過(guò)鍋爐加水閥調(diào)整電流至4～5 A。

如電流過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致蒸餾不徹底而影響檢測(cè)結(jié)果?？稍谡麴s的同時(shí)關(guān)閉鍋爐電源開(kāi)關(guān)，觀察鍋爐進(jìn)水后再打開(kāi)鍋爐開(kāi)關(guān)，然后通過(guò)鍋爐加水閥調(diào)整電流至4～5 A。

4 滴 定

滴定是飼料粗蛋白測(cè)定操作的最后一步，影響滴定結(jié)果的因素主要有以下幾個(gè)方面。

4.1 標(biāo)準(zhǔn)滴定液的標(biāo)定

標(biāo)準(zhǔn)滴定液標(biāo)定的準(zhǔn)確性直接影響檢測(cè)結(jié)果，因此滴定液標(biāo)定必須嚴(yán)格按照國(guó)標(biāo)要求進(jìn)行。在基準(zhǔn)稱量準(zhǔn)確的基礎(chǔ)上，滴定時(shí)為減少滴定誤差，8個(gè)平行樣加熱前顏色應(yīng)一致，加熱后鹽酸消耗最好不超過(guò)一滴。

4.2 準(zhǔn)確讀數(shù)

滴定讀數(shù)的準(zhǔn)確度也直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。滴定時(shí)讀數(shù)不準(zhǔn)、誤讀、滴定液灑漏或滴定管中有氣泡都將不同程度地影響檢測(cè)結(jié)果。因此滴定前要排出滴定管中所有氣泡，并把握好活塞松緊度，防止滴定液灑漏。

5 小 結(jié)

實(shí)驗(yàn)室工作是一項(xiàng)科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)、耐心細(xì)致的工作，一個(gè)樣品，要得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，從樣品采集、粉碎磨樣到最后結(jié)果計(jì)算都需要處處小心、時(shí)時(shí)注意。實(shí)驗(yàn)室任何項(xiàng)目及指標(biāo)的測(cè)定都有其關(guān)鍵環(huán)節(jié)，飼料粗蛋白檢測(cè)也是如此，關(guān)鍵是需要操作者在檢測(cè)操作實(shí)踐中一絲不茍、用心體會(huì)、認(rèn)真把握、力求精益求精。只有通過(guò)不斷的歸納總結(jié)，才能逐步提高自身的檢測(cè)操作技能和工作效率。