響應(yīng)面法優(yōu)化紅螞蟻抗菌物質(zhì)提取工藝

陳海燕，馮 印，楊 柳，尤麗新，陳曉平*

（1.長春科技學(xué)院生物食品學(xué)院，吉林 長春 130600；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

響應(yīng)面法優(yōu)化紅螞蟻抗菌物質(zhì)提取工藝

陳海燕1，馮 印1，楊 柳1，尤麗新1，陳曉平2,*

（1.長春科技學(xué)院生物食品學(xué)院，吉林 長春 130600；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

以長白山野生紅螞蟻為原料，提取紅螞蟻體內(nèi)有效抗菌活性物質(zhì)并進(jìn)行抑菌效果評價(jià)。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、離心轉(zhuǎn)速對紅螞蟻提取物抑制大腸桿菌的影響，結(jié)果表明：最佳浸提條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)63%、料液比1∶26（g/mL）、離心轉(zhuǎn)速7 230 r/min，對大腸桿菌抑菌圈直徑為2.59 cm。

響應(yīng)面法；紅螞蟻；抗菌物質(zhì)

螞蟻具有較高的藥用價(jià)值，具有明顯的抗炎、護(hù)肝、平喘、鎮(zhèn)痛功效，并具有一定的抗癌作用。此外，螞蟻體內(nèi)還含有一類特殊的物質(zhì)，因其對細(xì)菌、真菌等的生長具有明顯的抑制作用，被稱為“螞蟻抗生素”[1-4]。

螞蟻體內(nèi)含有大量的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素及微量元素[5]等，研究發(fā)現(xiàn)，螞蟻可分泌具有抗菌活性物質(zhì)，以此抵御環(huán)境微生物侵襲[6-7]。目前已報(bào)道螞蟻中抗菌物質(zhì)主要有多糖或聚合糖類、抗菌肽、激素及代謝后的小分子物質(zhì)并具有潛在的藥用價(jià)值。長白山紅螞蟻?zhàn)陨砘钚晕镔|(zhì)不僅具有鎮(zhèn)靜、止咳、平喘、消炎等效果，對真菌及金黃色葡萄球菌具有抑制作用，因此長白山紅螞蟻具有“天然抗生素”之稱[8-10]。

本研究以長白山野生紅螞蟻為原料，采用乙醇浸提法對紅螞蟻體內(nèi)抗菌物質(zhì)進(jìn)行粗提取。以抑菌圈直徑為衡量指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、離心轉(zhuǎn)速對紅螞蟻抑菌物質(zhì)提取效果的影響，以其獲得最佳提取工藝參數(shù)，為紅螞蟻開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長白山野生紅螞蟻由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品工程教研室提供。大腸桿菌（Escherichia coli）為長春科技學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

LB液體培養(yǎng)基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 7.2，補(bǔ)雙蒸水至1 L。

乙醇 北京化工廠；蛋白胨（BR）、酵母浸粉（BR） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉（BR） 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（AR） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HD-1360超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海江萊生物科技有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海嘉鵬科技有限公司；SHZ-D型循環(huán)水真空泵 鄭州科達(dá)機(jī)械儀器設(shè)備有限公司；LG10-2.4A型高速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；FA1004A電子天平 常州科源電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料預(yù)處理

取紅螞蟻100 g，用蒸餾水漂洗干凈，放在托盤內(nèi)攤平。將托盤放入烘箱，在40 ℃條件下烘干12 h以上，直至其質(zhì)量恒定，然后用組織粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過60 目篩得紅螞蟻粉，備用。

1.3.2 乙醇法提取紅螞蟻抗菌物質(zhì)的單因素試驗(yàn)

分別以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和離心轉(zhuǎn)速作為變量因素，其他影響因素條件不變，對紅螞蟻抗菌物質(zhì)進(jìn)行粗提取，分析不同變量因素對提取率的影響，以確定各因素水平的最佳值。

1.3.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對紅螞蟻抗菌物質(zhì)提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取25 g紅螞蟻粉，平均分為5份，按料液比1∶20（g/mL）分別加入體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液各100 mL，用電動(dòng)勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，置于4 ℃冰箱浸提24 h。然后分別放入高速冷凍離心機(jī)中，離心20 min（4 ℃，8 000 r/min）。取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40 ℃條件下?lián)]去溶劑乙醇，然后置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，所得物質(zhì)即為紅螞蟻乙醇提取物。分別溶于10 mL無菌蒸餾水，以大腸桿菌為受抑菌做抑菌實(shí)驗(yàn)[8]，觀察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下提取的紅螞蟻抗菌物質(zhì)抑菌圈直徑大小。

1.3.2.2 料液比對紅螞蟻抗菌物質(zhì)提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取25 g紅螞蟻粉，平均分為5份，分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）加入60%乙醇溶液，用電動(dòng)勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，置于4 ℃冰箱浸提24 h。然后分別放入高速冷凍離心機(jī)中，離心20 min（4 ℃，8 000 r/min）。方法同1.3.2.1節(jié)。試驗(yàn)重復(fù)3 次，求平均值。

1.3.2.3 離心轉(zhuǎn)速對紅螞蟻抗菌物質(zhì)提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取25 g紅螞蟻粉，平均分為5份，在料液比1∶20（g/mL）條件下加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液各100 mL，置于電動(dòng)勻漿機(jī)中進(jìn)行勻漿，在4 ℃冰箱浸提24 h。放入高速冷凍離心機(jī)，在4 ℃條件下分別以轉(zhuǎn)速6 000、7 000、8 000、9 000、10 000 r/min離心20 min。方法同1.3.2.1節(jié)。試驗(yàn)重復(fù)3 次，求平均值。

1.3.3 瓊脂孔穴擴(kuò)散法測定抑菌效果

采用瓊脂空穴擴(kuò)散法[11-12]，首先將菌種進(jìn)行活化處理，將大腸桿菌接種至LB液體培養(yǎng)基，振蕩使菌種均勻散布于培養(yǎng)基中，將其置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，活化2～3 次。將加熱融化的LB固體培養(yǎng)基15 mL注入到平皿中，待凝固后，吸取103CFU/mL的受試菌液100?L加入平皿，涂布均勻，在培養(yǎng)基上打直徑為6 mm的圓孔。用移液槍吸取40 ?L抗菌物質(zhì)粗提液加入孔洞，并做陰性、陽性對照。陰性對照組加入40 ?L無菌蒸餾水，陽性對照組加入40 ?L 100 ?g/mL的氨芐青霉素溶液。將培養(yǎng)基平皿在37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)24 h。觀察紅螞蟻抗菌物質(zhì)粗提液對大腸桿菌有無抑菌效果，并測量抑菌圈直徑。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化紅螞蟻抗菌物質(zhì)提取條件

通過單因素試驗(yàn)得到每個(gè)因素水平的3 個(gè)最優(yōu)數(shù)據(jù)，以Design-Expert軟件要求的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)三因素三水平優(yōu)化試驗(yàn)[13-16]。采用大腸桿菌為受抑菌，測量不同提取條件下紅螞蟻抗菌物質(zhì)粗提物的抑菌圈直徑。試驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算平均值。設(shè)計(jì)方案見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對紅螞蟻抗菌物質(zhì)提取的影響

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對紅螞蟻抗菌物質(zhì)提取的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of antimicrobial compounds

由圖1可知，在料液比1∶20、離心轉(zhuǎn)速8 000 r/min的條件下，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，所提取紅螞蟻抗菌物質(zhì)抑菌圈直徑先增大后減小。當(dāng)以60%乙醇進(jìn)行提取時(shí)，所提取抗菌物質(zhì)抑菌圈直徑為2.04 cm，提取效果最佳。已有研究[17-18]發(fā)現(xiàn)紅螞蟻中所含抗菌物質(zhì)主要為肽類，其他研究[19-21,23]中利用此方法提取時(shí)，提取物的菌圈直徑略小。2.2 料液比對紅螞蟻抗菌物質(zhì)提取的影響

圖2 料液比對紅螞蟻抗菌物質(zhì)提取的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction efficiency of antimicrobial compounds

由圖2可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、離心轉(zhuǎn)速8 000 r/min的條件下，隨著溶劑用量增大，抑菌圈直徑表現(xiàn)為逐漸增大并趨于平穩(wěn)的趨勢。當(dāng)料液比為1∶25時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值，為2.48cm。徐立等[22]研究的提取液經(jīng)干燥成粉狀，主要針對抗炎鎮(zhèn)痛等臨床效果，忽略了抗菌效果研究。

2.3 離心轉(zhuǎn)速對紅螞蟻抗菌物質(zhì)提取的影響

圖3 離心轉(zhuǎn)速對紅螞蟻抗菌物質(zhì)提取的影響Fig.3 Effect of centrifugal speed on the extraction efficiency of antimicrobial compounds

由圖3可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶20的條件下，隨著離心轉(zhuǎn)速的增大，抑菌圈直徑表現(xiàn)為先增大后減小的趨勢。當(dāng)離心轉(zhuǎn)速為7 000 r/min時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值，為2.18 cm。

2.4 瓊脂孔穴擴(kuò)散法測定抑菌效果

圖4 紅螞蟻抑菌成分對大腸桿菌的抑菌效果Fig.4 Antibacterial effect of red ant extracts

長白山野生紅螞蟻抑菌物質(zhì)對大腸桿菌的抑菌效果如圖4所示，1號孔陽性對照即100 ?g/mL氨芐青霉素溶液對大腸桿菌的抑菌圈直徑為2.48 cm，抑菌效果很好，2號孔陰性對照即蒸餾水對大腸桿菌無抑菌效果，3、4號孔紅螞蟻抑菌成分提取液對大腸桿菌的抑菌圈平均直徑為2.59 cm。通過陰性及陽性對照，可知紅螞蟻抑菌成分提取液對大腸桿菌的抑菌效果很好，其有效抗菌成分可與中成藥復(fù)配治療男性性功能疾病[24-26]。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

由表2可知，不同提取條件下得到的紅螞蟻抗菌物質(zhì)粗提物的抑菌圈直徑范圍為1.67～2.55 cm，顯然抗菌物質(zhì)的提取受不同條件影響較大[24]。故采用響應(yīng)面法對紅螞蟻抗菌物質(zhì)的提取條件進(jìn)行優(yōu)化是可行的。

2.5.2 模型的建立與方差分析

對響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果建立二次模型及進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the response surface quadratic model

由表3可知，該二次方程模型P＜0.000 1，達(dá)到極顯著影響水平。乙醇體積分?jǐn)?shù)一次項(xiàng)（A）、料液比一次項(xiàng)（B）、離心轉(zhuǎn)速一次項(xiàng)（C）以及乙醇體積分?jǐn)?shù)二次項(xiàng)（A2）、料液比二次項(xiàng)（B2）、離心轉(zhuǎn)速二次項(xiàng)（C2）P值均小于0.000 1，對抑菌圈直徑的大小有極顯著影響，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比的交互項(xiàng)（AB）、料液比和離心轉(zhuǎn)速的交互項(xiàng)（BC）P值在0.0001～0.05，達(dá)到顯著影響水平。而乙醇體積分?jǐn)?shù)和離心轉(zhuǎn)速的交互項(xiàng)（AC）則對抑菌圈直徑大小的影響不顯著。

模型F值為881.14，P＜0.000 1，說明該二次多項(xiàng)模型顯著性良好；失擬分析表明，失擬項(xiàng)的P值為0.062 5，設(shè)計(jì)模型的失擬度不顯著，因而該模型的擬合程度比較好。響應(yīng)面二次方程模型的相關(guān)系數(shù)為擬合度R2=0.999 1，說明模型與數(shù)據(jù)擬合度較好；校正擬合度=0.998 0，預(yù)測擬合度=0.985 9。其中=0.985 9與=0.998 0在一致性上是合理的。

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用Design-Expert軟件，得到關(guān)于抑菌圈直徑的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=2.55+0.17A+0.18B+0.11C+0.055AB-0.012AC-0.045BC-0.29A2-0.29B2-0.21C2。

2.5.3 各因素對紅螞蟻抗菌物質(zhì)提取的影響

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比對提取紅螞蟻抗菌物質(zhì)影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the effect of the effect of ethanol concentration and material-to-liquid ratio on the extraction efficiency of antimicrobial compounds

由圖5可知，在離心轉(zhuǎn)速7 000 r/min的條件下，響應(yīng)面圖中影響因素乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比的曲面均較陡，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對所提取的紅螞蟻抗菌物質(zhì)的抑菌圈直徑大小均有極顯著影響，呈二次關(guān)系。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%～60%，接近60%，料液比1∶22.5～1∶25，更加接近1∶25時(shí)，抑菌圈直徑為最大值。而隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和溶劑用量的增大，抑菌圈直徑逐漸減小。此外在等高線圖中等高線趨于橢圓形，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比的交互項(xiàng)對抑菌圈大小具有顯著影響。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與離心轉(zhuǎn)速對提取紅螞蟻抗菌物質(zhì)影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effect of ethanol concentration and centrifugal speed on the extraction efficiency of antimicrobial compounds

由圖6可知，在料液比1∶25的條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)和離心轉(zhuǎn)速的曲面均較陡，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和離心轉(zhuǎn)速對所提取的紅螞蟻抗菌物質(zhì)的抑菌圈直徑大小均有極顯著影響，呈二次關(guān)系。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%～60%，接近60%，離心轉(zhuǎn)速6 500～7 000 r/min，更加接近7 000 r/min時(shí)，抑菌圈的直徑達(dá)到最大。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和離心轉(zhuǎn)速的增加，抑菌圈直徑卻逐漸減小。此外在等高線圖中等高線實(shí)際趨于圓形，乙醇體積分?jǐn)?shù)和離心轉(zhuǎn)速的交互項(xiàng)對抑菌圈大小的影響不顯著。

圖7 料液比與離心轉(zhuǎn)速對提取紅螞蟻抗菌物質(zhì)影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots showing the effect of material-to-liquid ratio and centrifugal speed on the extraction efficiency of antimicrobial compounds

由圖7可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%的條件下，響應(yīng)面圖中影響因素料液比和離心轉(zhuǎn)速的曲面均較陡，說明料液比和離心轉(zhuǎn)速對所提取的紅螞蟻抗菌物質(zhì)的抑菌圈直徑大小均有極顯著影響，呈二次關(guān)系。當(dāng)料液比為1∶22.5～1∶25，接近1∶25，離心轉(zhuǎn)速為6 500～7 000 r/min，更接近7 000 r/min時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值。而隨著溶劑用量和離心轉(zhuǎn)速的繼續(xù)增大，抑菌圈直徑逐漸減小。此外在等高線圖中等高線趨于橢圓形，料液比和離心轉(zhuǎn)速的交互項(xiàng)對抑菌圈直徑大小具有顯著影響。2.6 乙醇浸提法提取紅螞蟻抗菌物質(zhì)的最佳工藝條件

通過Design-Expert軟件求解關(guān)于抑菌圈直徑的二次多項(xiàng)回歸方程，得到紅螞蟻抗菌物質(zhì)的最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)63.15%、料液比1∶26.67（g/mL）、離心轉(zhuǎn)速7 229.5 r/min，在此條件下的抑菌圈直徑理論值為2.62 cm。鑒于實(shí)驗(yàn)的可行性，采用修正后的提取條件，即乙醇體積分?jǐn)?shù)63%、料液比1∶26（g/mL）、離心轉(zhuǎn)速7 230 r/min。進(jìn)行3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，求平均值，得到抑菌圈直徑為2.59 cm，與理論值的相對誤差為1.16%，說明該二次多項(xiàng)回歸方程與實(shí)際情況吻合，采用響應(yīng)面法優(yōu)化紅螞蟻抗菌物質(zhì)的提取條件是可行的。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)主要研究長白山紅螞蟻抗菌活性物質(zhì)的提取并通過抑菌實(shí)驗(yàn)表明此類抗菌物質(zhì)對大腸桿菌具有良好的抑制效果。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)，確定了紅螞蟻抗菌物質(zhì)的最佳提取條件。并有待于進(jìn)一步嘗試其對金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、枯草芽孢桿菌等在食品加工貯藏中常見的有害菌進(jìn)行系統(tǒng)抗菌研究。并針對長白山野生紅螞蟻中抗菌活性物質(zhì)的成分分析進(jìn)一步細(xì)化研究，因此長白山野生紅螞蟻具有良好的應(yīng)用前景。

通過對響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，采用乙醇浸提法從紅螞蟻中提取抗菌物質(zhì)的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)63%、料液比1∶26（g/mL）、離心轉(zhuǎn)速7 230 r/min。優(yōu)化條件下，長白山紅螞蟻乙醇浸提液對大腸桿菌抑菌圈直徑為2.59 cm。

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Optimization of Extraction of Antibacterial Compounds from Red Ants with Response Surface Methodology

CHEN Hai-yan1, FENG Yin1, YANG Liu1, YOU Li-xin1, CHEN Xiao-ping2,*
(1. College of Biotechnology and Food Science, Changchun University of Science and Technology, Changchun 130600, China; 2. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Antibacterial compounds were extracted from wild red ants from the Changbai Mountains and their antibacterial activity was evaluated. The anti-E. coli activity as a function of ethanol concentration, solid-to-solvent ratio and centrifugal speed was investigated using response surface methodology. The diameter of the inhibition zone against E. coli was 2.59 cm under the optimal extraction conditions: 63% aqueous ethanol, a solid-to-solvent ratio of 1:26 (g/mL) and centrifugation at a speed of 7 230 r/min.

response surface methodology; red ant; antimicrobial compounds

TS201.3

A

1002-6630（2014）22-0073-05

10.7506/spkx1002-6630-201422014

2014-06-11

吉林省重大科技資助項(xiàng)目（20060208）

陳海燕（1980—），女，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称飞c功能性食品。E-mail：haiyan821088@163.com

*通信作者：陳曉平（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞c功能性食品。E-mail：13578883136@163.com