酵母菌葡萄糖耐量因子的純化

孔凡華，劉 鷺，張書文，蘆 晶，李紅娟，薛海曉，趙麗麗，周志江,*，呂加平,*

（1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

酵母菌葡萄糖耐量因子的純化

孔凡華1，劉 鷺2，張書文2，蘆 晶2，李紅娟2，薛海曉2，趙麗麗2，周志江1,*，呂加平2,*

（1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

以高鉻酵母菌粉為研究對(duì)象，采用溫和的純化方法，通過(guò)氨水提取高鉻酵母菌粉中的酵母菌葡萄糖耐量因子（glucose tolerance factor，GTF），聯(lián)用SuperdexTM75和Sephadex G25凝膠過(guò)濾層析對(duì)提取物進(jìn)行粗分離，然后用反相高效液相色譜對(duì)提取物進(jìn)行再分離，從而對(duì)GTF進(jìn)行高效純化研究。將GTF純化品作用于胰島素抵抗型3T3-L1脂肪細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖消耗量，分析GTF純化品對(duì)細(xì)胞葡萄糖代謝調(diào)節(jié)活性。研究表明，GTF純化品可以有效提高胰島素抵抗型3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖的消耗?？梢?，經(jīng)過(guò)多步柱層析純化后，可以得到具有葡萄糖代謝調(diào)節(jié)活性的GTF純化品 。

酵母菌葡萄糖耐量因子；高鉻酵母粉；純化；胰島素抵抗型3T3-L1脂肪細(xì)胞；葡萄糖代謝

近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率迅速增長(zhǎng)。糖尿病患者體內(nèi)微量元素鉻含量明顯低于健康人[1-3]，臨床研究表明，補(bǔ)鉻對(duì)治療不同類型的糖尿?。á裥吞悄虿?、Ⅱ型糖尿病、妊娠糖尿病和類固醇引起的糖尿病等) 均有效[4-7]。酵母菌葡萄糖耐量因子（glucose tolerance factor，GTF）是一種高活性的鉻補(bǔ)充物，它是小分子的鉻結(jié)合物質(zhì)，三價(jià)有機(jī)鉻是其重要活性中心，含有半胱氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸[8]，GTF能提高胰島素的活性，促進(jìn)胰島素與細(xì)胞膜受體結(jié)合，利于機(jī)體組織對(duì)葡萄糖的吸收[9]。脂肪組織是胰島素的重要外周靶器官，在胰島素抵抗和Ⅱ型糖尿病的發(fā)病中起重要作用[10]。

國(guó)內(nèi)外許多研究者對(duì)GTF分離純化工作進(jìn)行了研究，Davies等[11]使用DEAE-cellulose分離純化酵母氨水提取物，結(jié)果顯示陰、陽(yáng)組分皆有 GTF 活性及鉻。Edens等[12]利用C18反相層析和離子對(duì)反相高效液相色譜對(duì)酵母提取物進(jìn)行純化研究，得到3 個(gè)結(jié)構(gòu)組分復(fù)雜的分離物。Liu lu[13-14]和Vincent[15]等通過(guò)凝膠過(guò)濾層析和高效液相色譜對(duì)酵母氨水提取物進(jìn)行分步分離，得到m/z比值分別為712.253 5和769.274 7的鉻結(jié)合物，但沒有對(duì)鉻結(jié)合物進(jìn)行活性分析。盡管從酵母中純化GTF的研究工作已經(jīng)有近60 年的歷史，研究者采用不同的分離方法純化出一些鉻絡(luò)合物，但到目前為止，仍沒有純化出GTF純品，GTF的結(jié)構(gòu)沒有得到完全解析，并且由于純化條件的苛刻（用強(qiáng)酸提取或強(qiáng)極性樹脂分離）[16-17]，可能導(dǎo)致純化后的GTF失去生物活性。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上嘗試通過(guò)溫和的純化方法：氨水提取[18]、凝膠過(guò)濾層析和反相高效液相色譜（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）對(duì)酵母菌葡萄糖耐量因子進(jìn)行純化研究，以3T3-L1胰島素抵抗型脂肪細(xì)胞[19]為評(píng)價(jià)模型，觀察GTF對(duì)脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗的影響，分析其對(duì)細(xì)胞葡萄糖代謝調(diào)節(jié)活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3T3-L1前脂肪細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫(kù)。

地塞米松、3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、胰島素 美國(guó)Sigma公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、胎牛血清 美國(guó)Corning公司；胰蛋白酶 美國(guó)Gibco公司；SuperdexTM75和Sephadex G25美國(guó)GE公司；鉻標(biāo)準(zhǔn)液（1 000 μg/mL） 中國(guó)計(jì)量科學(xué)院；硝酸、高氯酸均為優(yōu)級(jí)純；三氯化鉻、氨水、葡萄糖等均為國(guó)產(chǎn)分析純；酵母浸粉、大豆蛋白胨、瓊脂粉為生化試劑；分析用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

CXG常壓生物電腦層析系統(tǒng) 上海滬西分析儀器廠；UV2300分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；MDS-6微波消解/萃取儀 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；SIGMA 3K-15離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；AA6300火焰原子吸收分光光度計(jì) 日本島津公司；DL-CJ-IN高性能無(wú)菌試驗(yàn)臺(tái) 哈爾濱市東聯(lián)公司；TSAO HSINTH-3560高壓滅菌鍋 造鑫企業(yè)有限公司；YP2001N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HZQ-F160搖床培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)公司；BIOTECH-50BG自動(dòng)控制發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；Virtis Genesis冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Virtis公司；1525 Binary HPLC系統(tǒng) 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌葡萄糖耐量因子的粗提

通過(guò)50 L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝制備高鉻酵母菌體[20]，冷凍干燥得高鉻酵母菌粉。氨水提取菌粉中有機(jī)鉻[18]，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮處理后，冷凍干燥備用。

1.3.2 SuperdexTM75凝膠過(guò)濾層析條件

去離子水溶解高鉻酵母菌粉氨水提取物，離心后上規(guī)格為1.6 cm×60 cm的SuperdexTM75凝膠過(guò)濾層析柱，以50 mmol/L醋酸氨和0.15 mol/L氯化鈉（pH 6.0）混合液作為洗脫液，洗脫流速為0.3 mL/min，每10 min收集一管洗脫液，共收集60管，用紫外分光光度計(jì)在254 nm波長(zhǎng)處對(duì)各管洗脫液進(jìn)行檢測(cè)，微波消解，參照GB/T 15555.6—1995《固體廢物 總鉻的測(cè)定 直接吸入火焰原子吸收分光光度法》測(cè)定洗脫液中的鉻含量，收集第2個(gè)鉻峰洗脫液，冷凍干燥備用。

1.3.3 Sephadex G25凝膠過(guò)濾層析條件

去離子水溶解冷凍干燥的SuperdexTM75凝膠過(guò)濾層析第2個(gè)鉻峰洗脫液，過(guò)膜后上規(guī)格為1.6 cm×80 cm的Sephadex G25 凝膠過(guò)濾層析柱，以去離子水為洗脫液，洗脫流速為0.3 mL/min，每10 min收集一管洗脫液，共收集70 管，用紫外分光光度計(jì)在254 nm波長(zhǎng)處對(duì)各管洗脫液進(jìn)行檢測(cè)，微波消解，測(cè)定洗脫液中鉻含量，收集鉻峰，冷凍干燥備用。

1.3.4 反相高效液相色譜條件

去離子水溶解冷凍干燥的Sephadex G25凝膠過(guò)濾層析鉻峰洗脫液，進(jìn)一步用反相高效液相色譜制備性層析柱純化，色譜柱為XBridgeTMC18色譜柱（10 mm×250 mm，10 μm），流動(dòng)相A液，乙腈-三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）體積比1 000∶0.8，B液，水-TFA體積比1 000∶1。采用梯度洗脫的方法，洗脫15 min，乙腈20%～22%，洗脫流速為1.5 mL/min，每30 s收集一管洗脫液，共收集30 管，在254 nm波長(zhǎng)處對(duì)每管洗脫液進(jìn)行檢測(cè)，微波消解，測(cè)定洗脫液中鉻含量。收集鉻峰，繼續(xù)用反相高效液相色譜制備性層析柱分離，采用梯度洗脫的方法，洗脫12 min，乙腈60%～100%，洗脫流速為2 mL/min，每30 s收集1 管洗脫液，共收集24 管，在254 nm波長(zhǎng)處對(duì)每管洗脫液進(jìn)行檢測(cè)，微波消解，測(cè)定洗脫液中鉻含量。

1.3.5 GTF對(duì)胰島素抵抗型3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗的影響

3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于24 孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞匯合后接觸抑制48 h，換用含10 mg/L胰島素、0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，然后換用含10 mg/L胰島素培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，繼續(xù)用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)[21]，每2 d換液1 次，培養(yǎng)8～12 d，前脂肪細(xì)胞可分化為成熟脂肪細(xì)胞。將成熟脂肪細(xì)胞用10-7mmol/L胰島素誘導(dǎo)處理48 h使其成為胰島素抵抗型細(xì)胞[19,22]。用純化后的GTF作用抵抗型細(xì)胞，通過(guò)加或不加胰島素（10-7mmol/L）共同作用24 h，以鉻添加量反映GTF添加量，觀察GTF對(duì)細(xì)胞葡萄糖消耗的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 SuperdexTM75凝膠過(guò)濾層析結(jié)果

254 nm是GTF的特征吸收波長(zhǎng)，鉻是GTF的活性中心，因此本實(shí)驗(yàn)采用同時(shí)檢測(cè)254 nm波長(zhǎng)處吸光度和鉻含量來(lái)分析GTF的分布。由圖1可知，高鉻酵母粉氨水提取物經(jīng)SuperdexTM75凝膠過(guò)濾層析后，得到3 個(gè)A254nm峰，2 個(gè)鉻峰。酵母氨水提取物中組分比較復(fù)雜，一些雜質(zhì)也會(huì)在A254nm波長(zhǎng)時(shí)有較大吸光度，因此根據(jù)鉻峰判斷洗脫液中GTF的分布更有指導(dǎo)意義。根據(jù)凝膠層析分離原理，大分子物質(zhì)先于小分子物質(zhì)洗脫出來(lái)，故第1個(gè)鉻峰為大分子鉻蛋白，第2個(gè)鉻峰為小分子鉻蛋白。盡管目前為止還沒有 GTF分子質(zhì)量的確切報(bào)道，但國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)酵母提取物分離純化研究結(jié)果均表明[8,13,15,23]，GTF 為小分子物質(zhì)，因此可以判斷，第2個(gè)鉻峰為實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)物，因此收集第2個(gè)鉻峰洗脫液，冷凍干燥備用。

圖1 SuperdexTM75凝膠過(guò)濾層析Fig.1 Purif i cation with SuperdexTM75 gel chromatographic

2.2 Sephadex G25凝膠過(guò)濾層析結(jié)果

圖2 Sephadex G25凝膠過(guò)濾層析Fig.2 Purif i cation with Sephadex G25 gel chromatography

收集SuperdexTM75第2個(gè)鉻峰洗脫液，過(guò)Sephadex G25凝膠過(guò)濾層析柱，得到5 個(gè)A254nm峰，1 個(gè)鉻峰。其中鉻峰與第2個(gè)A254nm峰吻合?？梢娡ㄟ^(guò)SuperdexTM75和Sephadex G25凝膠過(guò)濾層析，可以去除大量雜蛋白，GTF得到初步純化。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)用RP-HPLC對(duì)鉻峰進(jìn)行純化，以分析其純度，并對(duì)鉻峰高效率分離。

2.3 RP-HPLC第1次純化

圖3 RP-HPLC第1次純化Fig.3 First purif i cation by RP-HPLC

由圖3可知，經(jīng)反相高效液相分離后得到3 個(gè)A254nm峰，1 個(gè)鉻峰，鉻峰和第1個(gè)A254nm峰重合。可見C18柱對(duì)GTF進(jìn)行了有效分離，去除了與GTF分子質(zhì)量相近的蛋白組分，對(duì)GTF的進(jìn)一步分離起到很好的純化效果。

2.4 RP-HPLC第2次分離純化

圖4 RP-HPLC第2次純化Fig.4 Second purif i cation by RP-HPLC

為分析RP-HPLC對(duì)GTF的純化效果及所得鉻峰的純度，收集第1次RP-HPLC鉻峰洗脫液，繼續(xù)用RP-HPLC進(jìn)一步純化，如圖4所示，在整個(gè)洗脫過(guò)程中，只出現(xiàn)一個(gè)A254nm峰和一個(gè)鉻峰，兩峰重合且對(duì)稱分布。綜上所述，通過(guò)聯(lián)用SuperdexTM75、Sephadex G25凝膠過(guò)濾層析和反相高效液相色譜純化，可以得到GTF純品。

2.5 GTF對(duì)胰島素抵抗型3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗的影響

圖5 GTF對(duì)胰島素抵抗型3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗的影響Fig.5 Effect of GTF on glucose consumption of insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes

文獻(xiàn)報(bào)道GTF能提高胰島素的活性功能，促進(jìn)胰島素與細(xì)胞膜受體結(jié)合，協(xié)同胰島素一起參與人體糖和脂質(zhì)代謝[9-10]。3T3-L1脂肪細(xì)胞是功能性評(píng)價(jià)中典型的模式細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)胰島素和高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)方法，誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞成為胰島素抵抗細(xì)胞模型，模擬Ⅱ型糖尿病環(huán)境，以研究葡萄糖耐量因子對(duì)體外脂肪細(xì)胞葡萄糖代謝的影響。如圖5所示，對(duì)胰島素抵抗型細(xì)胞，單獨(dú)加GTF時(shí)，隨著GTF添加量的增加，細(xì)胞葡萄糖消耗量呈一定的遞增趨勢(shì)，這可能是由于GTF通過(guò)p38 MAPK途徑促進(jìn)了細(xì)胞葡萄糖的消耗[24]。當(dāng)GTF與胰島素共同作用于細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞葡萄糖消耗量顯著增加，呈劑量依賴效應(yīng)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中鉻質(zhì)量濃度為1 μg/mL時(shí)，細(xì)胞葡萄糖消耗量可以提高2.5 倍，可見，分離純化得到的GTF純品，具有顯著調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的活性。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)用氨水提取高鉻酵母菌粉中葡萄糖耐量因子，通過(guò)SuperdexTM75、Sephadex G25凝膠過(guò)濾層析和反相高效液相色譜對(duì)其進(jìn)行純化，得到GTF純品。通過(guò)胰島素抵抗型3T3-L1脂肪細(xì)胞評(píng)價(jià)純化所得GTF對(duì)細(xì)胞葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明：在胰島素存在時(shí)，GTF可以顯著提高細(xì)胞葡萄糖消耗量，且呈劑量依賴效應(yīng)?？梢?，通過(guò)聯(lián)用SuperdexTM75和Sephadex G25凝膠過(guò)濾層析和反相高效液相色譜，可以對(duì)GTF進(jìn)行有效分離，純化所得GTF樣品具有顯著葡萄糖代謝調(diào)節(jié)活性。

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Purif i cation of Glucose Tolerance Factor (GTF) from High-Chromium Yeast

KONG Fan-hua1, LIU Lu2, ZHANG Shu-wen2, LU Jing2, LI Hong-juan2, XUE Hai-xiao2, ZHAO Li-li2, ZHOU Zhi-jiang1,*, Lü Jia-ping2,*
(1. School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China; 2. Institute of Agro-products Processing Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

In this study, a mild extraction procedure was used to purify glucose tolerance factor (GTF) from high-chromium yeast cells. GTF was extracted by ammonia from high-chromium yeast cells. SuperdexTM75 and Sephadex G25 gel fi ltration chromatography were adopted to purify the extracts. Reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) was used for further purif i cation. The glucose metabolism regulating activity of GTF was evaluated in insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes. This research showed that through multiple steps of column chromatography, the pure GTF was obtained, which could improve glucose metabolism in insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes.

yeast glucose tolerance factor; high-chromium yeast; purif i cation; insulin-resistant 3T3-L1adipocytes; glucose metabolism

Q939.99

A

1002-6630（2014）21-0001-04

10.7506/spkx1002-6630-201421001

2013-12-05

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371763）

孔凡華（1989—），女，碩士研究生，主要從事食品微生物研究。E-mail：kkfanhua@126.com

*通信作者：周志江（1960—），男，教授，博士，主要從事食品安全與食品生物技術(shù)研究。E-mail：zzj@tju.edu.cn呂加平（1963—），男，研究員，博士，主要從事食品微生物與發(fā)酵工程研究。E-mail：lvjp586@vip.sina.com