藍莓多糖對衰老小鼠運動耐力及抗疲勞效果研究

鄭 飛

（河南省淮陽縣衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 洛陽 466700）

藍莓多糖對衰老小鼠運動耐力及抗疲勞效果研究

鄭 飛

（河南省淮陽縣衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 洛陽 466700）

研究藍莓多糖（blueberry polysaccharides，BPs）對D-半乳糖誘導衰老模型小鼠的游泳耐力和相關(guān)生理指標的影響。將小鼠分為正常對照組、衰老模型對照組、BPs低、中、高劑量組，通過腹腔注射100 mg/（kg·d）（以體質(zhì)量計）D-半乳糖建立衰老模型，考察其對力竭游泳時間以及疲勞評價指標的影響。與模型對照組相比，BPs中、高劑量組能顯著延長小鼠力竭游泳時間（P＜0.05），BPs各劑量組對延長缺氧生存時間具有較好的效果；BPs低、中、高劑量組血乳酸含量分別較模型對照組降低了10.9%、21.2%、31.1%（P＜0.05）。此外，BPs中、高劑量組小鼠劇烈運動后血尿素氮、血乳酸和丙二醛含量顯著降低，BPs各劑量組小鼠的肝糖原、肌糖原含量和超氧化物歧化酶、乳酸脫氫酶活性均顯著升高，結(jié)果表明BPs具有極強的自由基清除能力及較好的抗疲勞作用。

藍莓多糖；D-半乳糖；抗疲勞；力竭游泳時間

藍莓（blueberry），杜鵑花科越橘屬，果實中含有豐富的維生素、膳食纖維、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等營養(yǎng)元素，其中藍莓中多糖及花青素含量較高。有研究表明[1-2]，藍莓果肉不僅具有良好的營養(yǎng)保健作用，還具有防止腦神經(jīng)老化、強心、抗癌、軟化血管、增強人機體免疫等功能。由于藍莓具有較高的保健價值，因此被世界糧農(nóng)組織推薦為五大健康水果之一。

有研究表明，多糖作為大分子物質(zhì)廣泛存在于自然界中的各種生物體內(nèi)，且大多數(shù)具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化以及降血糖等功能，已成為當前醫(yī)藥和食品領(lǐng)域研究與開發(fā)的熱點[3-5]。孟憲軍等[6]研究發(fā)現(xiàn)，藍莓多糖（blueberry polysaccharides，BPs）對羥自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基有較強的清除作用，藍莓多糖對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母均有一定的抑制作用。Kalea等[7]研究發(fā)現(xiàn)藍莓多糖會降低低密度脂蛋白及脂質(zhì)體的氧化，并且影響體內(nèi)細胞信號轉(zhuǎn)導的路徑，是血管內(nèi)壁黏多糖下降的主要誘因。目前，國內(nèi)外對藍莓多糖的研究主要集中在成分鑒定以及抗氧化功能等方面[8-10]，且研究結(jié)果均顯示藍莓多糖在清除自由基、抗氧化、抑菌效果等方面具有較強的生物活性，然而目前國內(nèi)外鮮見關(guān)于其對血糖和運動耐力影響的研究報道。因此，本實驗考察藍莓多糖對小鼠血糖水平及抗疲勞能力的影響，以豐富藍莓多糖在提高機體抗疲勞能力方面的證據(jù)，為藍莓多糖的在功能食品中的應用及產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮藍莓，無凍害，購于水果超市。

昆明種小鼠50 只，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量20～22 g。

D-半乳糖 美國Sigma-Aldrich公司；血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒、血乳酸（blood lactic acid，BLA）試劑盒、肝糖原（hepatic glycogen，HG）試劑盒、肌糖原（muscle glycogen，MG）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、血乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱、DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海齊欣科學儀器有限公司；超聲波清洗機寧波新芝生物科技有限責任公司；冷凍離心機 美國貝克曼公司；UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 藍莓多糖的制備

根據(jù)孟憲軍等[11]的方法并作改進：稱取藍莓果肉120 g，將原料果肉清洗后在-80 ℃速凍10 min后打漿，加入少量蒸餾水后用微波消解儀輔助提取。抽濾后將濾液5 000 r/min離心15 min。加少量水溶解果肉后重復提取2 次，將提取的上清液合并混勻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使溶液水分完全蒸發(fā)。加入95%乙醇、100%乙醇和丙酮分別處理，4 ℃放置24 h，3 000 r/min離心10 min，用Sevag法[12]除蛋白質(zhì)，將沉淀冷凍干燥后即得到藍莓粗多糖。

1.3.2 實驗動物條件和分組

實驗小鼠飼養(yǎng)條件：溫度18～22 ℃、相對濕度50%～55%，自然光照，自由采食和飲水。實驗前將50 只小鼠在實驗環(huán)境下給予基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)1 周，按體質(zhì)量隨機分成5 組（雌雄各半），分別是正常對照組，模型對照組，BPs低、中、高劑量組。正常對照組腹腔注射100 mg/（kg·d）（以體質(zhì)量計，下同）生理鹽水，其余4 組腹腔注射100 mg/（kg·d）D-半乳糖，周期為60 d。第41天，正常對照組灌胃蒸餾水，模型對照組腹腔注射D-半乳糖的同時灌胃蒸餾水，BPs低、中、高劑量組腹腔注射D-半乳糖的同時灌胃100、200、400 mg/（kg·d）劑量的BPs，連續(xù)給藥20 d。各組給予基礎(chǔ)飼料，自由飲水。

1.3.3 力竭游泳實驗

末次給藥30 min后，給予小鼠尾部負重體質(zhì)量5%的鉛絲，將各組小鼠分別放入10 個恒溫水池箱，水深（20±5）cm、水溫（25±1）℃，進行力竭游泳實驗。放入后立即計時，觀察小鼠游泳情況，并適時用玻璃棒撥動小鼠使其始終處于運動狀態(tài)。以開始至小鼠沉于水面下10 s后不能浮出水面的時間作為力竭游泳時間/min。1.3.4 常壓耐缺氧實驗

參考高輝等[13]的方法，分組及給藥方法同1.3.2節(jié)，末次給藥1.5 h后，將小鼠分組放入干燥瓶中，用凡士林封口保持瓶內(nèi)密閉，記錄小鼠死亡時間。

1.3.5 測試樣品的制備和檢測

力竭游泳實驗后，將小鼠斷頭取血致死，收集血液，4 000 r/min離心10 min，取上清液備用。所有處理均在4 ℃條件下完成。按BUN、BLA、HG、MG、MDA、SOD及LDH試劑盒說明結(jié)合紫外-可見分光光度計分別測定各指標。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 BPs對衰老小鼠力竭游泳時間及耐缺氧的影響

圖1 BPs對小鼠力竭游泳時間的影響Fig.1 Effect of BPs on exhaustive swimming time of aged mice

機體持續(xù)運動至力竭的時間及缺氧狀態(tài)下的生存時間可以反映機體的耐力，是評價疲勞狀態(tài)較為客觀的指標。目前構(gòu)建衰老動物模型的方法主要有注射D-半乳糖、臭氧損傷、去胸腺、采用老齡動物等。D-半乳糖因造模簡單、實驗周期相對較短，目前被廣泛用于衰老機理研究和抗疲勞藥物的藥效學評價[14-15]。如圖1所示，正常對照組和不同BPs劑量組小鼠力竭游泳時間均高于模型對照組，其中BPs低劑量組與模型對照組相比差異不顯著（P＞0.05），其余各組均顯著高于模型對照組（P＜0.05）。實驗結(jié)果表明小鼠力竭游泳時間與BPs劑量呈正相關(guān)，BPs高劑量組小鼠力竭游泳時間顯著高于BPs低、中劑量組（P＜0.05）。值得關(guān)注的是，BPs高劑量組更能延長小鼠力竭游泳時間，甚至超過正常對照組14.3%。結(jié)果說明藍莓多糖可顯著提高衰老小鼠的運動能力，延緩疲勞的發(fā)生。

盡管缺氧對機體是一種負面作用，可導致心腦等重要器官缺氧性損傷，引起氧供應能力不足而死亡，但缺氧耐受性卻是反映機體的代謝及應激性反應的一個重要參考指標。如圖2所示，模型對照組缺氧生存時間著顯低于其他各組（P＜0.05），隨著BPs含量的增加，BPs各劑量組對延長缺氧生存時間具有較好的效果，表明BPs能增強小鼠耐缺氧能力。孫立彥等[16]關(guān)于玉竹多糖對小鼠耐缺氧能力的研究證明玉竹多糖也能明顯延長缺氧小鼠的存活時間，提高缺氧小鼠存活率。

2.2 BPs對衰老小鼠相關(guān)生理指標的影響

能源物質(zhì)的消耗、代謝物質(zhì)的堆積是產(chǎn)生疲勞的重要原因[21]。常用的疲勞評價方法主要有兩個：運動耐力實驗和生化指標檢測。當肌肉活動和收縮時，體內(nèi)糖原含量減少，分解為乳酸并放出熱能供肌肉活動，當體內(nèi)糖原含量不足或供不應求時，就會產(chǎn)生明顯的疲勞現(xiàn)象。在反映疲勞的生化指標中，BUN、BLA和糖原等生化指標的改變最具代表性，也是檢測疲勞最常用的指標[17]。當糖原被大量消耗時，生物體活動能力降低，從而導致機體反應遲鈍，產(chǎn)生疲勞感。因此貯備糖原有利于減少蛋白質(zhì)和含氮化合物的分解代謝，提高機體耐力。

機體劇烈運動時，由于氧供應相對不足，乳酸等酸性代謝產(chǎn)物增多，從而引起肌肉收縮效率下降，因此，BLA是反映機體運動耐力好壞的主要指標。由表1可知，不同BPs劑量組小鼠BUN和BLA含量均低于模型對照組（P＜0.05），其中BPs高劑量組BUN含量顯著低于模型對照組（P＜0.05），與正常對照組接近，并且BUN含量與BPs劑量呈負相關(guān)關(guān)系。Younes等[18]研究了發(fā)酵纖維素產(chǎn)生多糖后對小鼠BUN的抑制作用，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)13.0%的多糖可降低小鼠BUN含量達37%，本實驗的結(jié)果也印證了該結(jié)論。BLA含量也呈現(xiàn)相似的變化規(guī)律，BPs低、中、高劑量組的BLA含量分別較模型對照組降低了10.9%、21.2%、31.1%，差異顯著（P＜0.05），BPs高劑量組的BLA含量甚至低于正常對照組10.4%（P＞0.05）。

表1 BPs對衰老小鼠的疲勞生理指標影響Table1 Effect of BPs on related physiological indexes of aged mice

由表1可知，不同BPs劑量組的HG含量高于正常對照組。與正常對照組相比，3 個劑量組的HG含量均顯著增加（P＜0.05）。有證據(jù)表明[19]，高強度運動2 h后，MG幾乎耗盡，由于MG逐漸減少，則HG水解增多以維持血糖的穩(wěn)定；如果HG耗竭，血糖含量將明顯下降，則運動不能持續(xù)。因此HG的儲量直接影響持續(xù)耐力運動的能力，是反映疲勞程度的敏感指標。從結(jié)果來看，BPs各劑量組能夠有效增強小鼠持續(xù)運動的能力。

表2 BPs對衰老小鼠MDA含量和SOD、LDH活性的影響Table2 Effect of BPs on MDA, SOD and LDH of aged mice

實驗考察了BPs對衰老小鼠的脂質(zhì)過氧化水平和血清抗氧化狀態(tài)的影響，由表2可知，隨BPs劑量的增加，血清中MDA含量均有所降低，并且BPs中、高劑量組的MDA含量與正常對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。與模型對照組相比，BPs低、中、高劑量組的血清SOD活性分別提高24.5%、35.4%和45.6%（P＜0.05），這表明BPs對血清SOD的調(diào)節(jié)效果非常明顯。此外，血清LDH活性也隨BPs劑量的增加顯著升高，但BPs中、高劑量組相比，血清LDH差異不顯著，也反映出BPs劑量對LDH活性的影響有限。以上結(jié)果表明BPs具有良好的體內(nèi)抗氧化活性，不僅顯著提高了體內(nèi)酶系統(tǒng)的抗氧化活力，而且能夠有效清除體內(nèi)自由基并防止細胞膜脂質(zhì)過氧化，這也許是BPs具有抗疲勞作用的關(guān)鍵機理之一。

3 討 論

疲勞是一種常見的生理現(xiàn)象，為過度勞動或運動引起機體生理生化功能改變而導致機體勞動或運動能力的暫時降低，機體生理過程不能持續(xù)其機能在特定水平或不能維持預定的運動強度，是防止機體發(fā)生機能衰竭而產(chǎn)生的一種保護性反應[20]。疲勞可以導致精神不振、四肢乏力、注意力不集中、活動遲緩、抵抗力下降等一系列后果，嚴重時可摧毀人體免疫系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)，故針對延緩或消除疲勞的研究具有十分重要的意義[21-22]。

通過研究BPs對小鼠力竭游泳時間及疲勞評價指標，結(jié)果表明BPs能夠不同程度地降低BLA、BUN含量，升高HG、MG含量，這個變化可 能是其發(fā)揮抗疲勞作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。基于此，BPs高劑量組的運動耐力時間比正常對照組延長了14.3%（P＜0.05），BPs高劑量組還有效增加了小鼠SOD、LDH活性，顯著降低小鼠劇烈運動后BUN、BLA和MDA含量，表明高劑量BPs具有極強的自由基清除能力，通過其抗氧化作用延長小鼠負重游泳及缺氧狀態(tài)下生存時間，這可能是產(chǎn)生抗疲勞作用的重要途徑之一。

大量研究發(fā)現(xiàn)[23-24]，短時間高強度運動引起的肌肉疲勞是由于肌肉中的能量貯存物質(zhì)ATP供應不足所致，當ATP下降到某種水平時，MG會進行糖酵解合成ATP，在此過程中會伴隨著乳酸的積累，導致機體內(nèi)氫離子濃度上升、肌肉pH值下降，最終導致肌肉收縮能力下降。當肌肉和血液中逐漸產(chǎn)生和積累這種酸性致疲勞性物質(zhì)（乳酸）時，會使人的體力衰竭，無法繼續(xù)進行有效活動，因此，糖原既是檢測抗疲勞作用的重要指標同時也是提高運動耐力的能源物質(zhì)之一。本實驗證實BPs高、中、低3 個劑量組的HG含量均顯著高于正常對照組（P＜0.05），說明BPs可以增加糖原的儲備，為肌體提供能源物資，具有緩解動物體力疲勞、增強運動耐力的作用。

[1] KALEA A Z, CLARK K, SCHUSCHKE D A, et al. Dietary enrichment with wild blueberries (Vaccinium angustifolium) affects the vascular reactivity in the aorta of young spontaneously hypertensive rats[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 2010, 21(1): 14-22.

[2] VENDRAME S, DAUGHERTY A, KRISTO A S, et al. Wild blueberry (Vaccinium angustifolium) consumption improves inflammatory status in the obese Zucker rat model of the metabolic syndrome[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 2013, 24(8): 1508-1512.

[3] 聶少平, 謝明勇, 曹樹穩(wěn). 純化茶多糖的抗氧化活性及其對兩種結(jié)腸癌細胞增殖抑制作用[J]. 營養(yǎng)學報, 2007, 29(1): 46-49.

[4] WANG Dongying, ZHAO Yan, SUN Yanfei, et al. Protective effects of Ziyang tea polysaccharides on CCl4-induced oxidative liver damage in mice[J]. Food Chemistry, 2014, 143(15): 371-378.

[5] 王強, 趙欣. 葡萄籽粗多糖的超聲波輔助提取工藝優(yōu)化、組成及抗氧化活性研究[J]. 食品科學, 2013, 34(10): 62-66.

[6] 孟憲軍, 劉曉晶, 孫希云, 等. 藍莓多糖的抗氧化性與抑菌作用[J].食品科學, 2010, 31(17): 110-114.

[7] KALEA A Z, LAMARI F N, THEOCHARIS A D, et al. Wild blueberry (Vaccinium angustifolium) consumption affects the composition and structure of glycosaminoglycans in Sprague-Dawley rat aorta[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 2006, 17(2): 109-116.

[8] REQUE P M, STEFFENS R S, JABLONSKI A, et al. Cold storage of blueberry (Vaccinium spp.) fruits and juice: anthocyanin stability and antioxidant activity[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2014, 33(1): 111-116.

[9] WANG S Y, CAMP M J, EHLENFELDT M K. Antioxidant capacity and α-glucosidase inhibitory activity in peel and flesh of blueberry (Vaccinium spp.) cultivars[J]. Food Chemistry, 2012, 132(4): 1759-1768.

[10] 郭弘璇, 呂兆林, 潘月, 等. 藍莓果中多糖及單糖構(gòu)成的研究[J]. 北京林業(yè)大學學報, 2013, 35(6): 144-147.

[11] 孟憲軍, 常瑜, 孫希云, 等. 微波輔助法提取藍莓多糖BBP0-2的分離純化及組分分析[J]. 食品科學, 2013, 34(12): 119-124.

[12] SEVAG M G, LACKMAN D B, SMOLENS J. The isolation of components of streptococcal nucleoproteins in serologically active form[J]. Journal of Biological Chemistry, 1938, 124: 425.

[13] 高輝, 李春艷. 二氫楊梅素對小鼠運動性疲勞的影響[J]. 食品科學, 2012, 33(21): 295-297.

[14] HYNDMANA C A, KIEFFERA J D, BENFEY T J. The physiological response of diploid and triploid brook trout to exhaustive exercise[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 2003, 134(1): 167-179.

[15] PARK J H, CHOI T S. Polycystic ovary syndrome (PCOS)-like phenotypes in the D-galactose-induced aging mouse model[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2012, 427(4): 701-704.

[16] 孫立彥, 劉振亮, 孫金霞, 等. 玉竹多糖對小鼠常壓耐缺氧作用的影響[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學學報: 自然科學版, 2008, 39(3): 335-338.

[17] 李莉, 趙效國, 馬龍, 等. 黑加侖提取物抗疲勞作用的動物實驗研究[J].營養(yǎng)學報, 2008, 30(5): 499-501.

[18] YOUNES H, DEMIGNé C, BEHR S R, et al. A blend of dietary fi bers increases urea disposal in the large intestine and lowers urinary nitrogen excretion in rats fed a low protein diet[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 1996, 7(9): 474-480.

[19] TAN Wei, YU Keqiang, LIU Yanyan, et al. Anti-fatigue activity of polysaccharides extract from Radix Rehmanniae Preparata[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2012, 50(1): 59-62.

[20] 宋偉峰, 蘇俊芳, 羅淑媛. 荔枝多糖抗疲勞作用的實驗研究[J]. 中藥材, 2012, 35(9): 1485-1487.

[21] NI Weihua, GAO Tingting, WANG Hailiang, et al. Anti-fatigue activity of polysaccharides from the fruits of four Tibetan plateau indigenous medicinal plants[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2013, 150(2): 529-535.

[22] WANG Jia, LI Shanshan, FAN Yuying, et al. Anti-fatigue activity of the water-soluble polysaccharides isolated from Panax ginseng C. A. Meyer[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2010, 130(2): 421-423.

[23] RAY A D, UDHOJI S, MASHTARE T L. A combined inspiratory and expiratory muscle training program improves respiratory muscle strength and fatigue in multiple sclerosis[J]. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation, 2013, 94(10): 1964-1970.

[24] DUQUETTE A M, ANDREWS D M. Tibialis anterior muscle fatigue leads t o changes in tibial axial acceleration after impact when ankle dorsiflexion angles are visually controlled[J]. Human Movement Science, 2010, 29(4): 567-577.

Anti-fatigue Effect of Polysaccharides Extracted from Blueberry in Mice

ZHENG Fei
(Institute of Huaiyang County Health Supervision in Henan Province, Luoyang 466700, China)

The effect of polysaccharides extracted from blueberry (BPs) on exhaustive swimming time and related physiological indexes in aged mice induced by D-galactose was investigated. Mice were randomly divided into normal control group, aged model group, low-dose BP group, middle-dose BP group, and high-dose BP group. The aged model was induced by D-galactose at a dose of 100 mg/(kg·d) for 60 consecutive days. After the administration of BPs for 20 consecutive days, the exhaustive swimming time and fatigue indexes were determined. The results showed that BPs could extend the exhaustive swimming time, decrease the contents of BUN, BLA and MDA, and obviously increase the reservation of HG, MG, SOD and LDH. To conclude, BPs have a good anti-fatigue effect. This study may provide theoretical evidence for the development of anti-fatigue drugs from BPs.

blueberry polysaccharides; D-galactose; anti-fatigue effect; exhaustive swimming time

TS201.2

A

1002-6630（2014）21-0249-04

10.7506/spkx1002-6630-201421049

2014-01-24

鄭飛（1968—），男，主治醫(yī)師，碩士，研究方向為營養(yǎng)與食品衛(wèi)生。E-mail：foodsci123@sina.com