甘文婷 (綜述)，孫 新，陸 琰(審校)

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣州 510623)

肺損傷是由物理性、化學(xué)性、藥物性、機械性和生物性等多種刺激因素引起的肺上皮細胞和內(nèi)皮細胞功能形態(tài)異常，從而釋放大量的炎性介質(zhì)導(dǎo)致肺表面活性物質(zhì)降低，肺泡損傷、水腫，肺組織纖維化等病理改變，最終引起以呼吸困難為主要表現(xiàn)的臨床常見疾病[1-2]。機械通氣、糖皮質(zhì)激素、肺表面活性物質(zhì)替代等經(jīng)典治療方法，可在一定程度上改善肺損傷患者的臨床表現(xiàn)和預(yù)后，但缺乏特效的治療方法。隨著再生醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展及肺損傷患者對預(yù)后及生活質(zhì)量要求的不斷提高，醫(yī)學(xué)工作者也在積極尋找新的治療方法改善患者預(yù)后，在一定程度上推動了細胞治療在肺損傷方面的研究發(fā)展。目前國內(nèi)外多項研究已陸續(xù)證實骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)可減輕脂多糖、博來霉素、大腸埃希菌內(nèi)毒素、支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)等引起的急慢性肺損傷[3-5]。并在活體中證明了BM-MSCs是通過旁分泌機制發(fā)揮其有利作用的[6-7]。人臍帶血間充質(zhì)干細胞亦同樣具有減輕高氧導(dǎo)致的新生小鼠肺損傷引起的BPD[8-10]。繼間充質(zhì)干細胞之后，近幾年關(guān)注度不斷升高的人羊膜上皮細胞(human amnion epithelial cells，hAECs)在減輕肺損傷的作用及其機制等方面的研究,也取得了一定進展。

1 hAECs的特點及其運用價值

hAECs是人羊膜細胞的組成部分[11]。人羊膜細胞來源于孕婦分娩后廢棄胎盤上的羊膜組織，是由受精卵發(fā)育至第8日的囊胚內(nèi)細胞團分化而來的，由hAECs和人羊膜間充質(zhì)干細胞兩種細胞構(gòu)成，保有最早的胚胎干細胞特性，具備向三個胚層組織分化的能力[12-13]。hAECs與BM-MSCs、人臍帶間充質(zhì)干細胞大多數(shù)表面抗原相似，CD29、CD73、CD105、CD90、CD44及多能性干細胞表面標志Oct4、Nanog均陽性表達，而CD14、CD34、CD45等造血干細胞標志及人類白細胞DR抗原均陰性表達[14-15]。其中hAECs還表達胚胎干細胞全能性表面標志SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60及TRA-1-81，這些均是保持胚胎未分化性能及維持全能分化潛能的重要標志性因子[11]。然而,hAECs雖具有干細胞特性，但從本質(zhì)上來說并不屬于干細胞，因為它不能無限生長，只是一類具有干細胞特性的上皮細胞，且其生物學(xué)特性與孕婦所處的孕期相關(guān)[16]。

近期有研究提出已在體外建立了無限增殖的hAECs，以期將其更好地用于疾病的治療[17]。典型的hAECs一般為圓形或橢圓形，可呈鋪路石樣生長，且表達上皮細胞標志角蛋白19，不表達波形蛋白。hAECs、BM-MSCs及人臍帶間充質(zhì)干細胞具有相似的干細胞特性，相比人臍帶間充質(zhì)干細胞，hAECs尚無顯著優(yōu)勢，但對于BM-MSCs需通過有創(chuàng)途徑獲得，且隨著年齡的增長，細胞數(shù)量顯著下降，分化能力降低，hAECs有來源豐富等眾多優(yōu)越性，因此其在肺損傷的運用價值將更加廣闊。

2 hAECs減輕肺損傷的作用及其機制

隨著hAECs的各種干細胞特性及眾多優(yōu)越性逐漸得到證實，其在治療肺損傷方面的研究日益增多，目前研究較多的為其在各種肺損傷中的作用及其機制。

2.1hAECs減輕肺損傷的作用及可能影響因素 2009年Cargnoni等[18]研究同種異體羊膜細胞及異種羊膜細胞(人羊膜細胞)在博來霉素所致C57BL/6小鼠肺損傷中的作用，提出無論是同種異體還是異種羊膜細胞均能減緩博來霉素引起的肺部炎癥及纖維化，兩者無顯著差異，從而提出人羊膜細胞具有干細胞特性及減輕肺損傷的作用。2010年Moodley等[19]通過研究經(jīng)靜脈移植hAECs對博來霉素所致免疫功能缺陷小鼠肺損傷的干預(yù)作用，發(fā)現(xiàn)hAECs通過減少肺內(nèi)炎性因子,如白細胞介素1、腫瘤壞死因子β等釋放、膠原沉積，表達Ⅱ型肺泡細胞表型等作用減輕肺部炎癥及纖維化,并促進肺損傷的修復(fù)，與其他干細胞來源的實驗研究相比，本實驗的移植成活率較高，從而提出干細胞移植存活率可能受導(dǎo)致肺損傷的原因、給藥方式、干細胞類型及實驗研究所用的免疫功能缺陷小鼠的影響。

2011年Murphy等[20]進一步研究證實,hAECs對博來霉素所致免疫功能正常小鼠的肺損傷也具有同樣的保護作用，更加突出了hAECs低免疫原性的優(yōu)勢，本實驗觀察到hAECs主要通過抑制腫瘤壞死因子α、白細胞介素6、轉(zhuǎn)化生長因子β等炎性因子減輕肺部炎癥及纖維化而其調(diào)節(jié)功能很可能受到機體對損害反應(yīng)的影響，且進一步研究單獨使用人羊膜間充質(zhì)干細胞在肺損傷中的作用十分必要。同時實驗中發(fā)現(xiàn)未受到博來霉素作用的免疫功能正常小鼠使用hAECs會引起一定程度的肺部炎癥，而該作用對正常肺部是否存在潛在的不良影響尚需深入研究，因為這與hAECs是否能運用于無肺損傷個體的預(yù)防性治療密切相關(guān)[18，20]。同年Vosdoganes等[21]發(fā)現(xiàn)hAECs通過宮內(nèi)移植，具有與在博來霉素所致小鼠肺損傷中相似的免疫調(diào)節(jié)作用，能減輕脂多糖引起的胎羊肺損傷，但不能阻止其引起的肺發(fā)育的改變。

2012年Murphy等[22]在之前研究結(jié)論的基礎(chǔ)上報道，對比hAECs在博來霉素所致表面蛋白C正常(Sftpc+/+)和表面蛋白C缺失(Sftpc-/-)的小鼠肺損傷中的作用，發(fā)現(xiàn)hAECs在(Sftpc+/+)小鼠中具有和之前研究中一致的減輕肺損傷的作用，而(Sftpc-/-)小鼠的肺損傷無任何改善，(Sftpc-/-)小鼠巨噬細胞的吞噬功能受損，這似乎提示hAECs對肺損傷的修復(fù)作用與宿主巨噬細胞功能是否正常有關(guān)。同年Hodges等[23]報道，宮內(nèi)hAECs移植可減輕宮內(nèi)胎羊機械通氣所致的肺損傷。近期Vosdoganes等[24]進一步報道,hAECs可改善高氧導(dǎo)致的新生小鼠肺損傷引起的類似BPD的肺組織改變和對生長發(fā)育的影響，并且正常對照組予以hAECs不會引起肺組織損害，與hAECs在脂多糖、博來霉素等引起的肺損傷中的作用相比，hAECs在該研究中改善肺損傷的作用較小，這可能與hAECs移植方式、移植的時間及損傷因素作用于肺組織的時間有關(guān)。

2.2人羊膜上皮細胞減輕肺損傷的機制 hAECs可減輕脂多糖、博來霉素、高氧等因素引起的肺損傷已得到證實，但其具體的作用機制尚不清楚。Cargnoni等[18]提出hAECs移植后在骨髓、腦、肺組織等臟器中均有定植，但其減輕肺損傷的作用機制可能是通過生長因子和細胞因子的旁分泌作用。細胞本身是否可分化修復(fù)肺組織尚不清楚，近些年相關(guān)機制的研究陸續(xù)增多。Moodley等[19]發(fā)現(xiàn),hAECs移植到肺損傷的小鼠中可表達肺組織相關(guān)標志甲狀腺素轉(zhuǎn)錄因子，而該因子為肺早期發(fā)育的標志是氣管形成和Ⅱ型肺泡細胞形成的關(guān)鍵性因素。Murphy等[20]提出,在目前的研究中仍然沒有合理證據(jù)證明在肺損傷的活體組織中保留有意義數(shù)量的活性hAECs，減輕肺損傷作用的大小似乎與hAECs是否在肺中定植及其多少無顯著正相關(guān)。

在隨后Tan等[25]研究小組成員的進一步研究中發(fā)現(xiàn),hAECs不僅通過減少小鼠肺部巨噬細胞的遷移使得巨噬細胞釋放減少達到減輕肺損傷的作用，而且可促進肺泡中巨噬細胞表型由主要的炎癥型M1轉(zhuǎn)化為修復(fù)型M2，這點在Ionescu等[6]對比骨髓間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)液與BM-MSCs對肺損傷的作用機制研究中也有提及。并提出這些影響至少部分與hAECs釋放的可溶性因子有關(guān)，而與細胞間的相互作用無關(guān)聯(lián)，從而進一步證實hAECs對肺損傷的修復(fù)作用主要通過免疫調(diào)節(jié)，而不是hAECs在肺中的定植。同年Vosdoganes等[21]通過宮內(nèi)移植hAECs實驗進一步證實了甲狀腺素轉(zhuǎn)錄因子的存在，通過觀察到的與Murphy等[20]研究相似的低移植率提出，hAECs對肺損傷的各種調(diào)節(jié)作用很可能是通過免疫調(diào)節(jié)而不是移植成活率。并首次用數(shù)據(jù)證實hAECs在胎羊中具有促進表面活性蛋白生成的能力，而這些活性蛋白對維持肺組織結(jié)構(gòu)、減輕肺部炎癥均有一定作用。Murphy等[22]進一步研究hAECs在肺損傷中的作用機制，發(fā)現(xiàn)了其他研究中提及的表面活性蛋白，根據(jù)實驗結(jié)果提出表面活性蛋白在減輕肺損傷過程中發(fā)揮重要作用。然而,該研究未觀察到其他實驗中提及的hAECs可在肺中定植及分化為肺上皮細胞[18]。

Hodges等[23]證實hAECs減輕肺損傷過程中表面活性蛋白SP-C的存在，提出hAECs在活體內(nèi)可分化為肺泡細胞，這點結(jié)論與其他研究有所不同，然而該實驗存在很多局限性，胎內(nèi)機械通氣所致的肺損傷在臨床新生胎兒中不存在、樣本量小，該作用在大樣本動物實驗中是否存在需進一步研究。hAECs具有與BM-MSCs同樣的減輕肺損傷的作用，目前許多研究均認為hAECs對肺損傷的修復(fù)作用是通過免疫調(diào)節(jié)實現(xiàn)的，但具體的作用機制尚不清楚，BM-MSCs與hAECs在治療肺損傷作用機制中有何異同尚需繼續(xù)考究。

3 人羊膜上皮細胞臨床應(yīng)用前景

目前hAECs的臨床前研究已涉及各個醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在不同原因所致急、慢性肺損傷方面的研究也日益增多，其中最受期待的莫過于在BPD中的運用。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，胎齡<30周的低出生體質(zhì)量乃至極低出生體質(zhì)量早產(chǎn)兒的存活率逐漸增高，早產(chǎn)出生及生后長時間和高濃度吸氧容易引起肺部炎癥及纖維化，而這些均是引起B(yǎng)PD高危因素，使得早產(chǎn)兒BPD的發(fā)生率逐漸升高，是重要的致死和致殘性疾病[2]。傳統(tǒng)的治療方法以激素治療為主，有研究報道激素治療BPD可導(dǎo)致肺泡壁厚度增加，對肺組織有不同程度的不利影響[26]。

目前，BM-MSCs、hAECs可減輕高氧所致的新生小鼠肺損傷在臨床前研究中已得到證實，基于hAECs眾多優(yōu)越性，若能將其運用于新生兒高氧肺損傷的臨床治療中，那將大大降低新生兒BPD的發(fā)生率，對減輕社會負擔(dān)及提高早產(chǎn)兒的生活質(zhì)量均有重大意義。hAECs具有向三個胚層分化的能力，除了在肺損傷方面的作用，hAECs在治療糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)耳等多個組織器官病變的臨床前研究也取得了一定進展，若能成功運用于臨床，hAECs在各個醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的作用將不可估量。近期有研究提出，間充質(zhì)干細胞在肺中的少量定植對肺損傷的長期修復(fù)可能發(fā)揮重要作用，且移植的時間與修復(fù)作用的程度也密切相關(guān)[9，27]。因此,對于一些研究中觀察到的定植于肺組織中的無意義數(shù)量的hAECs,在肺損傷中是否發(fā)揮作用及高氧肺損傷中hAECs的最佳移植時間、移植方式、移植劑量及運用于治療時三者最佳的搭配方式等的研究意義重大。目前對于分離、消化、提取、純化hAECs尚無統(tǒng)一的方法，hAECs中不可避免混雜有少量的人羊膜間充質(zhì)干細胞，對于不同研究組觀察到的hAECs移植后是否定植于肺組織中截然相反的結(jié)論，該現(xiàn)象的出現(xiàn)是否與可能混雜的人羊膜間充質(zhì)干細胞有關(guān)，在hAECs減輕肺損傷的作用中會不會存在人羊膜間充質(zhì)干細胞協(xié)同或單獨發(fā)揮作用尚不清楚。隨著科技的進步，相信關(guān)于hAECs運用于肺損傷治療的眾多疑惑將逐一解決，在不久的將來hAECs移植可成為臨床可行的減輕肺部炎癥及預(yù)防BPD的有效治療方法。

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