吳志昊 尤 鋒① 宋宗誠 胡金偉, 王麗娟 朱香萍 譚訓剛 李 軍

(1.中國科學院海洋研究所實驗海洋生物學重點實驗室 青島 266071;2.威海圣航水產(chǎn)科技有限公司 威海 264200;3.中國科學院大學 北京 100049;4.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院 青島 266109)

大菱鲆(Scophthalmus maximus)屬于菱鲆科(Scophthalmidae)、菱鲆屬(Scophthalmus)(Nelson,2006),原產(chǎn)于歐洲北海、波羅的海和地中海沿岸,自 1992年由黃海水產(chǎn)研究所引入我國,已成為我國北方主要的海水養(yǎng)殖品種。但是,近年來大菱鲆由于累代養(yǎng)殖和近親交配,造成孵化率、成活率下降,生長慢,抗逆性差等現(xiàn)象不斷發(fā)生(馬愛軍等,2010)。因此,采取有效方法對大菱鲆進行遺傳改良,從根本上解決大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)良種化問題已成當務之急。

多倍體作為細胞工程育種的重要組成部分,一直受到研究者和養(yǎng)殖業(yè)者的關(guān)注,特別是不育的三倍體生物可將用于繁殖的能量轉(zhuǎn)化到生長方面,避免了性腺發(fā)育和成熟繁殖階段生長停滯、肉質(zhì)下降和死亡率增高等現(xiàn)象,因而具有較高的經(jīng)濟價值(劉筠等,2003)。以大菱鲆為例,超過1齡的三倍體個體生長顯著快于二倍體個體(P＜0.05)。而且由于沒有因性成熟、產(chǎn)卵產(chǎn)精帶來的傷害,成熟三倍體個體的成活率比二倍體對照要高8%(Calet al,2006)。但是,三倍體魚因為具有三套染色體,不能進行正常的減數(shù)分裂而達不到性成熟,因此三倍體每代都需要進行人工誘導,既繁瑣,成功率又不高,制約了三倍體的大規(guī)模應用。而四倍體的生殖細胞由于含有偶數(shù)染色體組是可育的,成熟的四倍體與正常的二倍體雜交則可進行大批量的、一勞永逸的三倍體生產(chǎn),故四倍體的研究一直受到重視(尤鋒,1999)。20世紀80年代以來,通過染色體組調(diào)控技術(shù)誘導四倍體,在魚類遺傳育種領(lǐng)域已得到廣泛的應用,并在虹鱒(Salmo gairdneri)(Chourrout,1982)、斑點叉尾(Ictalurus punctatus)(Bidwellet al,1985)、羅非魚(Oreochromis niloticus和O.mossambicus)(Myers,1986)、鳙魚(Anstichthys nobilis)(洪云漢,1990)、水晶彩鯽(Carassius auratustransparent colored variety)(桂建芳等,1991)等魚類中進行了應用。但在海水魚類中僅在歐鱸(Dicentrarbus labrax)(Peruzziet al,2003)、黃金鱸(Perca flavescens)(Malisonet al,1993)、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)(李文龍等,2012)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)(衣啟麟等,2012)中有一些嘗試。到目前為止,有關(guān)大菱鲆四倍體的人工誘導,國內(nèi)外尚未見報道。本研究探索了靜水壓誘導大菱鲆四倍體受精卵染色體加倍的條件,并獲得了高誘導率的大菱鲆初孵仔魚,其結(jié)果將為大菱鲆四倍體成魚的獲得以及進一步三倍體規(guī)?；a(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用大菱鲆親魚均來自威海圣航水產(chǎn)有限公司,雌魚全長 40—60cm,雄魚全長 35—50cm。親魚在產(chǎn)卵季節(jié)前進行營養(yǎng)強化,并通過控光、控溫等方法進行生殖調(diào)控。親魚成熟后,選擇體型正常,性腺發(fā)育良好的同批親魚,人工收集質(zhì)量較好的精卵進行人工授精。授精及后續(xù)孵育過程水溫保持在14.8—15.5°C之間的恒定溫度下。各組實驗均有二倍體對照,并進行4次重復。

1.2 靜水壓適宜處理時刻的篩選

根據(jù)預備實驗結(jié)果,設(shè)置5個處理時刻梯度,分別為卵裂前 20min、17.5min、15min、12.5min、10min。實驗中,處理壓力為67.5MPa,處理時間為6min。處理后的受精卵正常孵化,統(tǒng)計各組受精率、原腸胚成活率、孵化率和誘導率,篩選最適處理起始時刻。

1.3 靜水壓適宜處理壓力的篩選

根據(jù)上述實驗結(jié)果,將處理時刻定為卵裂前15min,設(shè)置 5個處理壓力梯度,分別為 62.5MPa、65MPa、67.5MPa、70MPa、72.5MPa。實驗中,處理時間為6min。處理后的受精卵正常孵化,統(tǒng)計各組受精率、原腸胚成活率、孵化率和誘導率,篩選最適處理壓力。

1.4 靜水壓適宜處理時間的篩選

根據(jù)上述實驗結(jié)果,將處理時刻設(shè)定為卵裂前15min,處理壓力設(shè)定為67.5MPa,設(shè)置5個處理時間梯度,分別為 4min、5min、6min、7min、8min。處理后的受精卵正常孵化,統(tǒng)計各組受精率、原腸胚成活率、孵化率和誘導率,篩選最適處理起間。

1.5 正交實驗

根據(jù)單因子實驗篩選結(jié)果,設(shè)計3×3正交表,進行三因子三水平實驗,設(shè)置處理時刻分別為卵裂前20min、15min、10min;處理壓力分別為 62.5MPa、67.5MPa、72.5MPa;處理時間分別為 4min、6min、8min。處理后的受精卵正常孵化,統(tǒng)計各組受精率、原腸胚成活率、孵化率和誘導率。

1.6 胚胎及仔魚倍性鑒定

采用染色體制片計數(shù)和流式細胞儀檢測DNA相對含量進行倍性鑒定。

染色體制片:每誘導組和對照組選取 100—200粒原腸胚中期胚胎,進行秋水仙堿處理、0.075mol/L KCl低滲、卡諾氏液(甲醇:冰乙酸=3︰1)固定、滴片、空氣干燥、15%Giemsa染色,獲得的染色體制片在顯微鏡油鏡下觀察和計數(shù)。每一組隨機選取30個以上中期分裂相,計算其中四倍體分裂相所占比例即為該組誘導率。

流式細胞儀檢測 DNA相對含量:每誘導組和對照組采取 10尾以上初孵仔魚,分別搗碎、過 260目篩絹、DAPI染色、流式細胞儀(PARTEC,CCA-Ⅱ)檢測DNA相對含量。將二倍體對照DNA相對含量設(shè)為100,四倍體DNA 相對含量則應為200。四倍體檢出個體數(shù)與總檢測個體數(shù)比值即為四倍體誘導率。

1.7 數(shù)據(jù)分析

誘導組和對照組每組各取出約 1000粒受精卵,于600mL杯中孵育,計算受精率、原腸胚成活率、孵化率及誘導率。具體公式如下:

受精率(%) = 發(fā)育到囊胚期受精卵數(shù)/總上浮卵數(shù)×100%

原腸胚成活率(%) = 發(fā)育到原腸胚中期卵數(shù)/上浮卵數(shù)×100%

孵化率(%) = 正常初孵仔魚卵數(shù)/總上浮卵數(shù)×100%

誘導率(%) = 四倍體分裂相數(shù)/總分裂相數(shù)×100% 或四倍體初孵仔魚數(shù)/正常初孵仔魚數(shù)×100%

誘導組與對照組受精率的比例即為相對受精率,同理計算相對原腸胚成活率及相對孵化率。后文若無特殊說明均為相對受精率、原腸胚成活率及孵化率。

使用 SPSS16.0軟件計算平均值和標準差,并使用Duncan’s多重比較分析差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 胚胎發(fā)育、仔魚孵化及倍性鑒定

誘導組胚胎形態(tài)與對照組基本一致(圖1),在早期卵裂過程中可觀察到一些分裂不均衡的現(xiàn)象。在15.0—15.5°C孵化時魚苗約110h破膜,略晚于二倍體對照組(100h左右)。

二倍體大菱鲆染色體數(shù)為 2n=44(Bouzaet al,1994),因此將染色體數(shù)為 88的視為大菱鲆四倍體,計算大菱鲆四倍體誘導率(圖2)。而流儀測試則是以二倍體為對照,將二倍體對照組峰值設(shè)為 100,如果樣品峰值為200則視為四倍體。流儀倍性測定僅為原腸胚染色體制片結(jié)果進行部分驗證,結(jié)果顯示兩種方法結(jié)果基本一致,故本文各誘導組四倍體率使用原腸胚期染色體計數(shù)方法結(jié)果。

圖1 大菱鲆對照組(上)與誘導組(下)的胚胎發(fā)育觀察Fig.1 Embryo development of turbot in control and induction groups

圖2 大菱鲆二倍體對照(左)和人工誘導四倍體(右)的染色體中期分裂相(上,1000×)和流式細胞儀(下)檢測結(jié)果Fig.2 Chromosome(above,1000×) and histograms of ploidy analysis(below) of turbot in control(left) and induction groups(right)

2.2 單因子實驗結(jié)果

不同處理時刻、處理壓力和處理時間對受精率、原腸胚成活率、孵化率及誘導率的影響如圖3。卵裂前12.5min處理的受精率顯著高于其它各組(P＜0.05),其孵化率也相對較高,但卵裂前15min處理時誘導率較高,綜合考慮選擇卵裂前15min作為進一步實驗的處理時刻;67.5MPa處理的受精率、孵化率及誘導率均為幾個組中較高的,因此認為67.5MPa為較適處理壓力;處理時間各組之間均無顯著差異,但處理6min其誘導率相對較高,因此認為6min為較適的處理時間。

2.3 正交實驗結(jié)果

正交實驗結(jié)果見表1,結(jié)果顯示,處理時刻對原腸胚成活率和孵化率有顯著影響(P＜0.05),其中卵裂前15min處理效果最好。處理時刻對誘導率和孵化率的影響較處理壓力和處理時間更大(表2)。處理壓力和處理時間對受精率、原腸胚成活率、孵化率和誘導率影響均不顯著,但處理壓力的影響大于處理時間。

3 討論

人工誘導多倍體方法包括生物學、化學和物理學方法三大類。其中,生物學方法主要是通過遠緣雜交產(chǎn)生三倍體或四倍體后代,如 He等(2012)用紅鯽(♀)與翹嘴鲌(♂)雜交獲得了異源三倍體、四倍體。但這種方法受魚種的限制較大,僅在少數(shù)特定魚種中可獲得成功。化學法主要是利用秋水仙素(colchicine)和細胞松弛素B(cytochalasin B,CB)等化學藥品,抑制第二極體的排出或抑制早期卵裂,從而達到產(chǎn)生三倍體或四倍體的目的。但化學藥品具有毒性,在魚類中使用通常得到的是嵌合體,目前應用已較少(Chourrout,1984)。物理學方法主要包括溫度休克法和壓力休克法,是魚類三倍體、四倍體誘導最為常用的方法,操作起來較簡單、在生產(chǎn)實踐中容易被接受,但四倍體中溫度法誘導率較低。與溫度休克法相比,壓力休克法在魚類四倍體誘導中更加有效。其通過靜水壓機產(chǎn)生的高靜水壓來抑制受精卵卵裂,達到染色體加倍的目的,在四倍體誘導中尤其有效。其處理時間較短,壓力傳導均勻,對受精卵的損傷小,在適宜條件下可以獲得較高的成活率及誘導率(90%—100%),對冷、溫水性魚類都適用而被廣泛采用(Xuet al,2008)。本研究結(jié)果也表明,靜水壓法能夠有效地誘導大菱鲆四倍體。

表1 大菱鲆四倍體人工誘導正交實驗結(jié)果Tab.1 Results of orthogonal experiment in turbot tetraploid induction

表2 大菱鲆四倍體人工誘導正交實驗結(jié)果分析Tab.2 Analysis of orthogonal experiment in turbot tetraploid induction

圖3 不同處理時刻(a)、處理壓力(b)和處理時間(c)對受精卵受精率、原腸胚成活率、孵化率及誘導率的影響Fig.3 Effects of initiation time,treatment pressure and treatment duration on fertility rate,survival rate of gastrula stage,hatching rate and tetraploid rate

靜水壓處理效果主要是受處理時刻、處理持續(xù)時間和處理壓力強度三因素的影響。由本文結(jié)果可看出,不同處理時刻和不同處理壓力下,各誘導組之間的受精率、孵化率和誘導率存在顯著差異(P＜0.05);而不同處理時間下各誘導組間受精率、孵化率和誘導率差異均不顯著,說明處理時間實驗結(jié)果的影響較小,而合適處理時刻和處理壓力的確定更為重要,這也與正交試驗的結(jié)果基本一致。靜水壓誘導魚類四倍體是通過抑制受精卵卵裂使受精卵染色體加倍的,其處理時刻一般在第一次卵裂前,從受精至卵裂的孵育時間中,受精卵的低同步性、卵裂調(diào)控的復雜性以及外界的環(huán)境變化,都會對受精卵的發(fā)育造成影響,使得最佳處理時刻很難確定。若提前處理,則受精卵還未發(fā)育到預期程度就開始被處理,極大降低了誘導效率;若延后處理,則受精卵已經(jīng)開始卵裂,進而影響其對卵裂的抑制效果,導致非整倍體的產(chǎn)生,會導致死亡率的升高(Sakaoet al,2006)。為能準確的確定處理時刻,本實驗是根據(jù)易于觀察確定的第一次卵裂痕出現(xiàn)的時間,并結(jié)合對照組來計算處理時刻的。如此,可以減少水溫和氣溫等環(huán)境因素的影響。

到目前為止,成功獲得兩性可育且能自然繁殖的人工誘導四倍體魚的研究在鲆鰈魚類等純海水魚類中還未見報道。李文龍等(2012)利用靜水壓誘導得到半滑舌鰨的四倍體魚苗,其四倍體率達到 68.3%;衣啟麟等(2012)通過靜水壓方法誘導四倍體牙鲆,在培育到8—15cm的子代中檢測出13.3%的四倍體,但也遠未達到性成熟。本實驗在初孵仔魚中可檢測到超過70%的四倍體,但這些仔魚的死亡率往往較高,并且導致隨著誘導組仔魚的生長發(fā)育,其四倍體率逐漸降低。此外,實驗中也觀察到四倍體誘導組受精卵前期卵裂出現(xiàn)較多卵裂不均衡現(xiàn)象,其卵質(zhì)也遠低于采用同批精卵受精的二倍體對照組。這與牙鲆同質(zhì)雌核發(fā)育誘導中出現(xiàn)的現(xiàn)象十分相似(Wanget al,2008),作者推測這些現(xiàn)象可能與受精卵分裂異常導致非整倍體的產(chǎn)生有關(guān),抑或是加倍引起隱性致死基因的純合所致,但具體原因尚需進一步分析。

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