裴志花，高云航，馬紅霞，王 開，孟軻音

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春130118；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春130122）

兔巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌（Pm）引起的，主要侵害家兔呼吸系統(tǒng)的疾病。該病的發(fā)病率和死亡率都很高，對養(yǎng)兔業(yè)的危害和導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失日益嚴(yán)重，目前已成為危害養(yǎng)兔業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一。預(yù)防該病的商業(yè)疫苗主要有全菌苗、類毒素苗和減毒活疫苗，但它們不能提供或只能提供有限的異源保護(hù)，還有可能造成兔巴氏桿菌病的暴發(fā)。因此，探尋更為安全有效的新型疫苗來預(yù)防兔巴氏桿菌病勢在必行。

研究表明，多殺性巴氏桿菌外膜蛋白（Outer membrane proteins,OMPs）是主要免疫原，應(yīng)用外膜蛋白制備的疫苗對小鼠、雞和兔進(jìn)行免疫，顯示了明顯的保護(hù)力[1-4]。OMPH是Pm最主要的外膜蛋白之一，屬于孔蛋白，OMPH能誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生高水平的保護(hù)性抗體，是交叉保護(hù)應(yīng)答中最重要的抗原[5-7]。

試驗(yàn)選擇購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的兔多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株C51-2-499株的OMPH1基因作為研究對象，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆及序列分析并構(gòu)建原核表達(dá)載體，為進(jìn)一步進(jìn)行ELISA檢測及開展相關(guān)的免疫研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和抗體 兔多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株C51-2-499，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；表達(dá)載體pET30a、菌株DH5α及BL21(DE3)，均由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD-18T載體，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒、ExTaq聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶、IPTG、DNA Marker，均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DNA快速回收試劑盒，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；一抗為兔源多殺性巴氏桿菌免疫家兔制備的多克隆抗體，由本實(shí)驗(yàn)室制備；二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的綿羊抗兔IgG，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 表達(dá)引物的設(shè)計(jì) 參考已發(fā)表的序列，用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)上下游引物，并分別在兩5′端引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。引物序列如下：P1：5′-TGGATCCATGAAAAAGACAATCGTAC-3′，P2：5′-ATCTCGAGTGTACGCGTAAACCT-3′，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 目的基因的克隆

1.4.1 兔多殺性巴氏桿菌總DNA的提取 取2mL增菌液于微量離心管中，6 000 r/min離心5min，收集沉淀。將沉淀用500μL NET緩沖液溶解并于80℃水浴15min；從水浴鍋中取出微量離心管室溫放置2min后加入12μL溶菌酶，37℃消化4 h；再次取出離心管室溫放置2min，加入蛋白酶K、RNA酶50℃過夜消化；用等體積的酚-氯仿-異戊醇(體積比為25∶24∶1)混合物抽提2次，再用無水乙醇洗滌2次，放入溫箱中使離心管內(nèi)壁干燥；加入50μL無核酸酶的TE緩沖液溶解，置于-20℃冰箱中備用。

1.4.2 目的片段的擴(kuò)增、克隆、重組質(zhì)粒的鑒定及序列分析 以提取的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。將PCR產(chǎn)物純化回收后與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定，篩選出陽性克隆。將陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，此重組質(zhì)粒命名為pMD-OMPH1。利用DNAMAN軟件對測得的序列與不同動物來源的多殺性巴氏桿菌OMPH基因序列進(jìn)行比對分析。

1.5 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 用BamHⅠ和XhoⅠ從pMD-OMPH1上雙酶切下目的基因片段，純化回收后分別與用同樣雙酶切的pET30a相連，轉(zhuǎn)入BL21后挑斑提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切及PCR擴(kuò)增進(jìn)行鑒定，篩選出陽性克隆，重組質(zhì)粒命名為pET30a(+)-OMPH1。送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司對插入的DNA片段測序，以確證讀碼框是否正確。

1.6 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測 將pET30a(+)-OMPH1陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21中，挑取單克隆菌將其放入5mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃250 r/min培養(yǎng)過夜后取200μL接種于100mL的LB培養(yǎng)液中進(jìn)行重組菌的擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃250 r/min培養(yǎng)至OD600值至0.6-0.8時(shí)，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將收集的1.5mL菌液以10 000 r/min離心1min，棄上清液后用100μL pH值8.0的TE緩沖液懸浮，反復(fù)凍融3次后，取28μL樣品加入7μL的5×上樣緩沖液，水浴煮沸5min后進(jìn)行上樣電泳，并以相同條件下誘導(dǎo)的空載體菌液作為陰性對照。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色2-3 h，再脫色至底色褪去后觀察目的蛋白條帶，以蛋白質(zhì)Marker進(jìn)行比較，以確定目的帶的位置。

1.7 表達(dá)產(chǎn)物的Western-blotting檢測 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后，將凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上進(jìn)行免疫印跡，一抗為兔多殺性巴氏桿菌免疫兔制成的超免血清，二抗為HRP標(biāo)記的綿羊抗兔IgG，用底物二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和過氧化氫顯色。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆與鑒定 PCR反應(yīng)后得到1條約1 040 bp的目的片段。之后將目的基因克隆到pMD-18T載體上，測序分析表明，該基因序列與GenBank登錄的Pm OMPH1基因的核苷酸序列完全一致。

圖1 多殺性巴氏桿菌om pH1基因的同源性分析

2.2 核苷酸序列分析 利用DNAman軟件對測得的序列與不同動物來源的多殺性巴氏桿菌OMPH基因序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示（圖1）兔多殺性巴氏桿菌OMPH1基因與雞P-1662株（U52201.1）OMPH基因的同源性最高，基因序列相似性高達(dá)99%，與綿羊（JX473022.1）、牛（HM582886.1）、豬(EF102481.1)、和鴨（AY606823.1）源多殺性巴氏桿菌OMPH基因的同源性都很高，均＞85%。

2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 用BamHⅠ和XhoⅠ從pMD-OMPH1上雙酶切下目的基因片段，連接到用同樣雙酶切的表達(dá)載體PET30a（+）上，BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切分析表明，目的基因已正確插入表達(dá)載體（見圖2）。對篩選出的陽性克隆經(jīng)寶生物工程（大連）有限公司測序，證實(shí)目的基因已正確插入到表達(dá)載體的閱讀框中。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定

2.4 OMPH1基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的檢測 將pET30a(+)-OMPH1陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后、SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)菌在47.0ku處有一條目的條帶，與預(yù)期的目的蛋白大小一致（見圖3a），以同樣條件誘導(dǎo)的pET-30a(+)-BL21則沒有出現(xiàn)這一條帶，初步證明OMPH1基因得到了表達(dá)。

2.5 Western-blot分析 原核表達(dá)的OMPH1融合蛋白SDS-PAGE電泳后，進(jìn)行Western-blotting檢測時(shí)，出現(xiàn)了1條特異性的抗2抗體結(jié)合帶(見圖3b)，根據(jù)分子質(zhì)量的大小推測，這條帶的分子質(zhì)量與目的蛋白的分子質(zhì)量相同，從而證明表達(dá)的目的蛋白是OMPH1蛋白。

圖3 OMPH1基因表達(dá)產(chǎn)物的分析

3 討論

OMPH是多殺性巴氏桿菌菌體最主要的外膜蛋白之一，不同血清型的Pm OMPH蛋白具有很高的同源性，而其異源性主要源于318～333位上部分氨基酸的變異，而大部分的變異又集中在60-80aa和200～220aa兩個(gè)不連續(xù)的超變區(qū)。OMPH蛋白也是多殺性巴氏桿菌的一種主要的保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)很高水平的保護(hù)性抗體。兔多殺性巴氏桿菌OMPH蛋白編碼基因分為OMPH1基因和OMPH2基因兩部分，Garrido等從A血清群中鑒定了2個(gè)OMPH（OMPH1和OMPH2），經(jīng)驗(yàn)證這兩個(gè)基因的基因組是連續(xù)的并且可以獨(dú)立轉(zhuǎn)錄的[5]，其大小均為1 000 bp左右。本試驗(yàn)針對Pm OMPH1設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行目的基因的克隆，成功構(gòu)建了兔多殺性巴氏桿菌OMPH1基因原核重組表達(dá)載體，并進(jìn)行了IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，初步證明OMPH1基因獲得了高效表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至NC膜上進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)，顯色后可見明顯條帶，這表明表達(dá)蛋白能被兔多殺性巴氏桿菌陽性血清所識別，也證明了該表達(dá)蛋白具有免疫學(xué)活性，為兔多殺性巴氏桿菌診斷試劑和新型疫苗的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

目前，有人已開展了豬[8]、雞[9]、鴨[10]、牛多殺性巴氏桿菌OMPH的相關(guān)研究，而針對兔源Pm OMPH的相關(guān)研究，尚未見到。本試驗(yàn)通過PCR方法成功擴(kuò)增出1 041 bp的兔Pm OMPH1目的片段，將目的基因克隆到pMD-18T載體上。測序分析表明，該基因序列與GenBank登錄的Pm OMPH1基因的核苷酸序列完全一致，確定該基因?yàn)镻m OMPH1基因。利用DNAman軟件對測得的序列與不同動物來源的多殺性巴氏桿菌OMPH基因序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示兔多殺性巴氏桿菌OMPH1基因與雞（U52201.1）、綿羊（JX473022.1）、牛（HM582886.1）、豬(EF102481.1)、和鴨（AY606823.1）源多殺性巴氏桿菌OMPH基因的同源性都很高，均＞85%。以表達(dá)載體pET-30a(+)為基礎(chǔ)，成功地將pET-30a(+)-OMPH2陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中，為進(jìn)一步研究兔多殺性巴氏桿菌CVCC500株OMPH1的免疫原性及OMPH的DNA疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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