裴保河

（鶴壁市疾病預防控制中心，河南 鶴壁 458030）

冬凌草(Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara)又名冰凌草、延命草、彩花草等，為唇形科香茶屬多年生草本或亞灌木，自然分布于太行山南部。自古以來被太行山區(qū)的民間常年當作茶葉飲用。因其清熱解毒、清咽利喉、消止痛的功能盛行于當?shù)?，被譽為“神奇草”。1972年，中國食管癌研究中心，發(fā)現(xiàn)冬凌草具有獨特的抗食管癌，賁門癌、原發(fā)性肝癌功效，從此被廣泛應(yīng)用于臨床[1]。進入21世紀以來，國際腫瘤病學界和新藥研發(fā)機構(gòu)對冬凌草的抗癌作用格外關(guān)注，其化學成分及藥理活性研究取得較大進展[2]，從全株植物分離得到大量二萜類化合物、一些三萜、甾體、黃酮、生物堿、揮發(fā)油、氨基酸、有機酸及其他類化合物[3]。藥理研究表明，多個成分具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌消炎、降血糖、抗突變、免疫等活性[4-8]。冬凌草中的主要三萜類成分熊果酸具有較強的抗腫瘤活性[9]。研究表明[10]，熊果酸不僅對多種致癌、促癌物有抵抗作用,而且對多種惡性腫瘤細胞有抑制生長作用。因此提取冬凌草中熊果酸成分，開發(fā)新藥及保健食品具有廣闊的前景。

目前，關(guān)于冬凌草中冬凌草甲素等二萜類化合物提取研究較多[11]，但有關(guān)冬凌草中熊果酸的提取報道較少，袁珂[12]采用超臨界二氧化碳技術(shù)萃取冬凌草中熊果酸，得率較高，但該法時間較長。超高壓提取技術(shù)是在常溫條件下提取植物原料中有效成分，提取時間短、能耗低、有效成分破壞小[13]，目前在冬凌草中熊果酸的提取上還未見報道。本文研究超高壓提取冬凌草中熊果酸的工藝條件，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗優(yōu)化提取工藝，為冬凌草的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 2012年6月在鶴壁市食品藥品監(jiān)督管理局檢驗中心進行試驗。冬凌草，采自河南省鶴壁市淇河岸邊，新鮮成熟植株地上部分→70℃烘干→粉碎→20目過篩→真空包裝→備用；熊果酸對照品，中國藥品生物制品檢定所；乙醇試劑均為國產(chǎn)分析純。

SFP超高壓處理系統(tǒng)，英國SFP公司；XH-600US超聲波細胞粉碎機，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，廣州市捷晶能源科技有限公司；Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)，Agilent公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 超高壓提取冬凌草中熊果酸 在冬凌草粗粉中，加入不同體積、不同濃度的乙醇溶液，混合均勻后裝入聚乙烯塑料袋，進行真空包裝，然后放入超高壓裝置的壓力腔中，高壓處理一定時間，處理后過濾，3 500 r/min離心15 min，離心后減壓濃縮，測定熊果酸含量，計算熊果酸的得率。

1.2.2 回流提取冬凌草中熊果酸 在冬凌草粗粉中，按固液比1∶20(g:mL)加入75%乙醇溶液，加熱回流2 h。過濾，3 500 r/min離心15 min，離心后減壓濃縮，測定熊果酸含量，計算熊果酸的得率。

1.2.3 超聲提取冬凌草中熊果酸 在冬凌草粗粉中，按固液比1∶20(g:mL)加入75%乙醇溶液，采用220 W超聲處理30 min,過濾，3 500 r/min離心15 min，離心后減壓濃縮，測定熊果酸含量，計算熊果酸的得率。

1.2.4 熊果酸的HPLC測定 參照HPLC方法測定熊果酸[14]，色譜柱（Phenomsil BDS C18，4.6 mm×200 mm，5μm)，流動相：CH3OH：H2O：HAc為85∶15∶0.3，流速：1 mL/min，柱溫：35℃，檢測波長為215 nm。峰面積A與熊果酸濃度C（mg/mL）之間的回歸方程為A=381.63C-3.0644（R2=0.9996）。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓提取冬凌草中熊果酸單因素實驗

2.1.1 固液比對熊果酸提取得率的影響 采用70%乙醇溶液為溶劑，UHP壓力350 M下保壓4 min進行提取，不同固液比對熊果酸提取得率的影響見圖1。

由圖1可見，隨著固液比中溶劑用量的增加，熊果酸的提取得率增加，但當固液比達到1∶20（g：mL）后，再增加溶劑用量，得率增加緩慢。同時，過多的溶劑用量會帶來后續(xù)濃縮的強度增加，因此，綜合考慮，采用固液比1∶20較好。

2.1.2 乙醇濃度對熊果酸提取得率的影響 采用不同濃度的乙醇溶液為溶劑，固液比1∶20（g：mL），UPH壓力350 M下保壓4 min進行提取，乙醇濃度對熊果酸提取得率的影響見圖2。

由圖2可見，隨著乙醇濃度的增加，熊果酸的提取得率增加，但當乙醇濃度達到70%后，再增加乙醇濃度，得率反而下降。

2.1.3 UHP壓力對熊果酸提取得率的影響 采用70%乙醇溶液為溶劑，固液比1∶20（g：mL），在不同的UHP壓力下保壓4 min進行提取，UHP壓力對熊果酸提取得率的影響見圖3。

由圖3可見，隨著UHP壓力的增加，熊果酸的提取得率增加，但當UHP壓力達到300 MPa后，再增加壓力，得率反而下降。因此，采用300 MPa提取熊果酸較好。

2.1.4 保壓時間對熊果酸提取得率的影響 采用70%乙醇溶液為溶劑，固液比1∶20（g：mL），在UHP壓力300 MPa下保壓不同時間進行提取，保壓時間對熊果酸提取得率的影響見圖4。

由圖4可見，隨著UHP時間的增加，提取得率增加，但當UHP時間達到4 min后，再增加時間，得率增加緩慢。因此，采用4 min提取熊果酸較好。

2.2 提取工藝條件的優(yōu)化 在單因素的基礎(chǔ)上，選用L9(34)正交試驗表，以熊果酸得率為指標，考察固液比、乙醇濃度、UHP壓力、UHP時間對熊果酸得率的影響，試驗設(shè)計和結(jié)果分別見表1和表2。

表1 因素與水平

表2 正交試驗

由表2極差分析結(jié)果可知，各因素對熊果酸得率的影響程度依次為：D＞C＞B＞A，即：UHP時間＞UHP壓力＞乙醇濃度＞固液比。優(yōu)化的提取條件為 A3B3C3D2,即：UHP時間4 min、UHP壓力320 MPa、乙醇濃度75%、固液比1∶22。采用冬凌草2 kg，按上述最佳條件進行驗證試驗，熊果酸得率為0.322%。

2.3 不同提取方法提取熊果酸的比較 將冬凌草分別采用超高壓提取、回流提取和超聲方法進行提取，比較提取后熊果酸得率和提取所用的時間，結(jié)果見表3。

表3 3種方法提取冬凌草中熊果酸的得率和提取時間

從表3中可見，3種不同的提取方法中，超高壓提取不僅得率高，而且提取時間短。

3 討論

冬凌草是一種資源豐富的藥食兩用的植物資源，是開發(fā)保健食品的較好原料,為有效對其利用,對其活性成分熊果酸的分離提純藥理學進行深入研究，開發(fā)精制、深加工轉(zhuǎn)化產(chǎn)品是其發(fā)展方向。

目前熊果酸最常用的方法是回流法，該法對設(shè)備條件要求不高，操作方法簡單，但熊果酸提取率不高，且提取時間長；通過采用超聲強化提取可提高得率，縮短時間，但超聲容易造成有效成分的破壞，且提取仍然需要30 min以上；超微粉碎方法通過對細胞進行破壞，提高提取得率，但其對細胞的破壞程度有限，得率還有待提高。本研究采用超高壓提取，是通過加壓破壞冬凌草的細胞，促進熊果酸溶出。在提取過程中，細胞在壓力作用下破壞，但由于為非熱提取，熊果酸破壞小，且提取工藝中，細胞在幾分鐘內(nèi)即破壞，提取時間大大縮短，得率得到提高。

4 結(jié)論

采用超高壓提取冬凌草中熊果酸的優(yōu)化工藝條件為固液比1∶22、乙醇濃度75%、UHP時間4 min和UHP壓力320MPa，熊果酸得率可達0.322%，具有時間短，得率高的特點，在提取冬凌草中熊果酸中具有很好的應(yīng)用前景。

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