李艷玲，劉永錄，于 瑞，張國祖

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院藥物工程系，河南 鄭州450011；2.河南康星藥業(yè)有限公司，河南 中牟451464）

超微粉碎技術(shù)是近20年發(fā)展起來的一項(xiàng)跨學(xué)科、跨行業(yè)的高新技術(shù)，應(yīng)用這種技術(shù)可將固體物料粉碎成直徑小于10μm的粉體。它在中藥制藥行業(yè)的應(yīng)用雖然起步較晚，但已顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景。將它應(yīng)用于中藥制劑的制備，可大幅度地提高藥材中有效成分的釋放和在體內(nèi)的吸收[1-2]。到目前為止，關(guān)于中藥超微粉的藥動(dòng)學(xué)報(bào)道越來越多，但在獸藥領(lǐng)域?qū)τ谶@方面的研究報(bào)道還是較少，特別是直接運(yùn)用到雞個(gè)體本身去研究相關(guān)的藥動(dòng)學(xué)的更少。

黃連解毒散具有清熱瀉火解毒之功效,在獸醫(yī)臨床上廣泛應(yīng)用于敗血癥、膿毒血癥、痢疾等各種急性炎癥?；邳S連解毒散在禽病防治中應(yīng)用的廣泛性，本試驗(yàn)分別給雞灌服黃連解毒散超微粉和普通粉后，采用HPLC測(cè)定黃連解毒散中有效成分小檗堿和梔子苷的在糞便中的含量，以期驗(yàn)證黃連解毒散經(jīng)超微粉碎后有效成分在雞體內(nèi)的變化規(guī)律及其生物利用度，為黃連解毒散超微粉的臨床應(yīng)用提供借鑒和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 黃連解毒散由黃連、黃柏、黃芩和梔子按規(guī)定比例混合而成。黃連解毒散普通粉由粉碎機(jī)粉碎，過80目篩。黃連解毒散超微粉由河南康星藥業(yè)有限公司采用超微粉碎技術(shù)制成，過400目篩。

1.1.2 動(dòng)物 AA肉雞37日齡。

1.1.3 儀器 Waters液相色譜儀和Waters.2487雙波長UV檢測(cè)器（美國Waters公司）；超微粉碎機(jī)（開封市同創(chuàng)超細(xì)粉體工程技術(shù)開發(fā)中心）。

1.1.4 試劑 梔子苷（批號(hào)：110749-220714）和小檗堿（批號(hào)：110713-200911）標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品(由中國藥品生物制品檢定所提供)，甲醇和乙腈為色譜純，水為重蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 樣品的收集 150只雞隨機(jī)分為甲、乙、丙3組，每組50只。甲組灌胃給80目的黃連解毒散，2 g/只；乙組灌胃給400目的黃連解毒散，2 g/只，丙組灌胃給400目的黃連解毒散，1 g/只，給藥2.5 h后開始收集糞便，2.5～3.5 h，3.5～4.5 h、4.5～5.5 h、5.5～6.5 h、6.5～7.5 h、7.5～8.5 h、8.5～9.5 h、9.5～10.5 h時(shí)間段收集糞便。60℃以下溫度充分干燥，稱重，研細(xì)，進(jìn)行含量測(cè)定。

1.2.2 小檗堿的測(cè)定

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱為XBriageTMC18（4.6mm×250mm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水（40∶60），0.1%磷酸水內(nèi)含0.1%十二烷基磺酸鈉，流速1mL·min，柱溫30℃，波長346 nm。

1.2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇制成50μg/mL溶液，即得。

1.2.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液1mL，加甲醇稀釋到100mL的容量瓶中，制成0.5μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，精密吸取1、2、5、10、20μL分別進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以對(duì)照品量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo),計(jì)算回歸方程：y=21.973x+28.999，r=0.9999（n=6），說明小檗堿在0.5～25μg/mL呈良好的線性關(guān)系。

1.2.2.4 精密度試驗(yàn) 吸取對(duì)照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，RSD為0.032%，說明精密度良好。

1.2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批樣品5份，按供試品溶液的制備方法處理后，分別進(jìn)樣10μL，結(jié)果RSD為1.72%（n=5）。

1.2.2.6 回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的樣品5份，精密加入一定量的小檗堿對(duì)照品，按超聲波提取方法分別制備供試品，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均回收率為97.6%，RSD為0.65%。

1.2.2.7 樣品液的制備 稱取干燥的雞糞1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇15mL，超聲30min后，濾入25mL量瓶中，甲醇洗滌錐形瓶和濾液一并濾入量瓶中，定容至刻度，用0.22 nm濾膜過濾，即得。

1.2.2.8 樣品的測(cè)定 吸取樣品液10μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，見圖1、圖2，計(jì)算樣品中小檗堿的含量。結(jié)果見表1。

圖1 小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品

圖2 小檗堿樣品

表1 雞糞中小檗堿的排出量 （X±SD）

1.2.3 梔子苷的測(cè)定

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱為大連依利特C18（4.6mm×250mm），流動(dòng)相為甲醇：水（31∶69），流速為1mL/min，柱溫為30℃，波長為238 nm。

1.2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取梔子苷對(duì)照品適量，加甲醇制成90μg/mL溶液，即得。

1.2.3.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液1、2、4、6、8mL于5個(gè)10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度。各進(jìn)樣10μL,按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以對(duì)照品量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),計(jì)算回歸方程為y=20.648x-4.9657，相關(guān)系數(shù)r=0.9999．梔子苷在18～180μg/mL呈良好的線性關(guān)系。

1.2.3.4 精密度試驗(yàn) 吸取對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，RSD為0.083%，說明精密度良好。

1.2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品5份，按供試品溶液的制備方法處理后，分別進(jìn)樣10 μL，用外標(biāo)法計(jì)算梔子苷含量，其RSD分別為1.87%（n=5），表明該法重現(xiàn)性良好。

1.2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的樣品5份，精密加入一定量的梔子苷對(duì)照品，按超聲波提取方法分別制備供試品，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均回收率為98.1%，RSD為2.68%，表明該方法可行。

1.2.3.7 樣品液的制備 稱取干燥的雞糞1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇15mL，超聲30min后，濾入25mL量瓶中，甲醇洗滌錐形瓶和濾液一并濾入量瓶中，定容至刻度，用0.22 nm濾膜過濾，即得。

1.2.3.8 樣品的測(cè)定 吸取樣品液10μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，見圖3、圖4，計(jì)算樣品中梔子苷的含量。結(jié)果見表2。

圖3 梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品

圖4 梔子苷樣品

表2 雞糞中梔子苷的排出量 （X±SD）

2 結(jié)果與分析

2.1 超微粉碎對(duì)黃連解毒散中小檗堿吸收的影響 表1是雞分別灌服過黃連解毒散的普通粉和超微粉后，測(cè)得的不同時(shí)間段雞糞中小檗堿的含量。表1結(jié)果表明，灌服相同劑量的黃連解毒散，超微粉組和普通粉組相比，雞糞便中小檗堿的量沒有顯著差異（P＞0.05）；當(dāng)超微粉組的劑量是普通粉劑量的1/2時(shí)，雞糞中小檗堿的量也基本減半。說明經(jīng)過超微粉碎并沒有增加小檗堿在雞體內(nèi)的吸收。

2.2 超微粉碎對(duì)黃連解毒散中梔子苷吸收的影響

表2是雞分別灌服過黃連解毒散的普通粉和超微粉后，測(cè)得的不同時(shí)間段雞糞中梔子苷的含量。表2結(jié)果表明，灌服相同劑量的黃連解毒散，超微粉組和普通粉組相比，超微粉組雞糞中梔子苷的總量明顯減少，兩組相比有顯著差異（P＜0.05），說明經(jīng)過超微粉碎增加了梔子苷在雞體內(nèi)的吸收。

3 討論

很多相關(guān)報(bào)道都證明中藥經(jīng)過超微粉碎后，其中的有效成分吸收利用度會(huì)大大增加，如對(duì)扶正解毒散超微粉在感染IBDV的雞體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果表明，和普通粉相比，扶正解毒散超微粉在雞體內(nèi)的吸收較快,分布也較快。穿心蓮經(jīng)超微粉碎后,可顯著提高其有效成分穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的生物利用度等[4]。

植物藥材經(jīng)過超微粉碎后，由于細(xì)胞破壁，有效成分的溶出理論上應(yīng)該是增多加快，在動(dòng)物體內(nèi)的生物利用度也應(yīng)該增加。由表1可以看出，小檗堿的排出量甲組和乙組是相當(dāng)?shù)?，甲組是丙組的2倍，說明經(jīng)過超微粉碎后并沒有增加小檗堿在體內(nèi)的吸收利用度。分析其原因，可能是小檗堿由于溶解度不好，在體內(nèi)的吸收很差，有文獻(xiàn)報(bào)道小檗堿在體內(nèi)的吸收利用度只有2.3%[3]，所以當(dāng)小檗堿在體內(nèi)的吸收達(dá)到飽和時(shí)，即使再增加小檗堿在體內(nèi)溶出量，也不會(huì)被機(jī)體所吸收，最后都隨糞便排出。由表2可以看出，梔子苷的排出量甲組是乙組1.44倍、是丙組的3.5倍，說明超微粉碎后梔子苷在體內(nèi)的吸收利用度大大增加，大約能提高44%。有報(bào)道稱梔子苷由于在體內(nèi)整個(gè)腸道都有吸收，具有廣泛的吸收窗，容易吸收[5]，經(jīng)過超微粉碎后細(xì)胞破壁，梔子苷的溶出增加，所以能大幅度增加其生物利用度。

通過本試驗(yàn)說明，超微粉碎并不是適合于所有的中藥材，對(duì)于在體內(nèi)吸收利用度好的成分經(jīng)超微粉碎后，能大幅度增加其生物利用度，而對(duì)于溶解度差、吸收不好、在體內(nèi)容易達(dá)到飽和的成分，超微粉碎是否有意義有待于進(jìn)一步研究。

該試驗(yàn)通過測(cè)定雞糞中黃連解毒散有效成分小檗堿、梔子苷的排出量，進(jìn)而推測(cè)小檗堿、梔子苷在雞體內(nèi)的吸收利用情況，和原來的采血測(cè)血藥濃度的方法相比，簡單易行，且避免疼痛使雞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)而影響成分的吸收，精確度高，具有較高的推廣價(jià)值。

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[2]杜軍.超微粉碎-提高獸藥生物利用度的有效方法[J].中國獸藥雜志，2004，38（2）：51-53．

[3]高海鵬，肖飛，馬紅偉，等.鹽酸小檗堿在雞體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究[J].中國獸藥雜志，2009，43（3）：31-34.

[4]韓鳳梅，蔡文濤，夏啟松，等.穿心蓮片中脫水穿心蓮內(nèi)酯在大鼠血漿中的藥代動(dòng)力學(xué)[J].中華中醫(yī)藥雜志，2005，20（4）：206-209.

[5]杜先華，牛欣，馮前進(jìn).梔子苷在大鼠體腸吸收動(dòng)力學(xué)的研究[J].華西藥學(xué)雜志，2008，23（5）：558-560.