豬圓環(huán)病毒2型感染的診斷

于 淼，何希君，于文會(huì)

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱150001）

對(duì)于豬圓環(huán)病毒2型感染的診斷方法，目前有PCR技術(shù)、多重PCR、巢式PCR方法、競爭PCR方法、熒光定量PCR、原位雜交技術(shù)、DNA芯片技術(shù)等檢測(cè)技術(shù)[1]。本文通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、免疫組織化學(xué)(IHC-P)和免疫熒光（IFA）的方法，對(duì)送檢病豬樣本進(jìn)行檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和淘汰感染豬，減少由PCV引發(fā)的疾病，對(duì)降低養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失十分必要。

1 臨床癥狀

對(duì)57例PCV-2陽性病豬的臨床癥狀統(tǒng)計(jì)，消瘦、被毛粗亂是PCV-2相關(guān)疾病的主要臨床表現(xiàn)。進(jìn)行性呼吸困難、皮膚蒼白也是大部分病例的臨床特征。部分豬有皮炎、黃疸、下痢和嗜睡等癥狀。皮炎主要表現(xiàn)為四肢末梢，尤其是后肢有出血斑（見中插彩版圖1）。

2 病理變化

對(duì)57例PCV-2陽性病例的剖檢病理變化表明，所有病例都出現(xiàn)淋巴結(jié)病變，有不同程度的出血。腎臟出現(xiàn)病變，主要是腎臟腫大、有灰白色斑，部分腎臟出血。脾臟病變，表現(xiàn)為腫大、邊緣出血，也有少部分不腫大、質(zhì)地變脆。胸腹水和彌漫性肺炎也是觀察到的重要病理變化，部分病例可見肝臟花斑狀條紋，回腸或結(jié)腸黏膜充血、淤斑（見中插彩版圖2）。

3 材料與方法

3.1 材料 PCV-2陽性病料由本實(shí)驗(yàn)室鑒定保存；送檢病料：2013年4月-2013年10月的194份臨床病料。其他常規(guī)試劑均為分析純。

3.2 PCR檢測(cè)

3.2.1 引物設(shè)計(jì) 參考GenBank中公開發(fā)表的PCV-2 ORF2的核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成1對(duì)引物，片段跨度為整個(gè)ORF2，長751 bp。

引物序列如下：PCV-2：Cap1 5′-TTCGGTACCA GCTATGACGTATCCAAG-3′；PCV2：Cap2 5′-GCCAAGCTTTCACTTCGTAATGGTTTT-3′。

3.2.2 用于PCV-2檢測(cè)的組織病料DNA的提取豬的淋巴結(jié)，加適量滅菌PBS，勻漿后，取300μL用于DNA提取。用Viral DNA/RNA Kit，根據(jù)試劑盒操作說明書提取組織總DNA。

3.2.3 PCR 總體積為30μL，包括2條PCV-2引物（10μLmol/L）各1μL，dNTP（2.5mmol/L）2.0μL，10×Buffer 3μL，Taq酶（5U/μL）0.25μL，模板DNA 3μL，加滅菌雙蒸水20μL，瞬時(shí)離心混勻。PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃欲變性5min；94℃45 s，58℃45 s，72℃1min；共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。取8μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，以出現(xiàn)751 bp特異條帶的樣品為陽性。

3.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

3.3.1 材料 一抗：Anti-PCV-2 antibody(RTI公司，美國)，1∶100稀釋；二抗：Anti-Mouse IgG-Peroxidase antibody produced in rabbit（Sigma公司，美國），1∶100稀釋。

3.3.2 方法 石蠟切片脫蠟、甲醇內(nèi)處理、封閉、加一抗、二抗（含HRP標(biāo)記）、DAB顯色、染核、脫水透明、樹膠封片。

3.4 免疫熒光檢測(cè)

3.4.1 材料 一抗：anti-PCV-2 antibody（RTI公司，美國），1∶100稀釋；F4/80macrophage antibody（Dako，丹麥），1∶100稀釋；二抗：FITCHorse Anti-Mouse IgG monoclone antibody（Sigma，美國），1∶200稀釋；Texas Red Horse Anti-Rat IgGmonoclone antibody（Vector公司，瑞士），1∶200稀釋。

3.4.2 熒光染色 石蠟切片脫蠟、高壓、脫脂乳封閉、添加PCV-2一抗和二抗、添加F4/80一抗和二抗、添加DAPI、封片膠封片、激光共聚焦顯微鏡觀察。

4 結(jié)果

4.1 PCV-2PCR 檢測(cè)結(jié)果來自57份樣品中擴(kuò)增出PCV2特異條帶，與陽性對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果一致（見圖3）。

圖3 PCV-2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

4.2 PCV-2免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 選取的部位是豬頜下淋巴結(jié)，其陽性信號(hào)呈黃棕色，主要位于淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的胞漿中,偶爾出現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi)和上皮細(xì)胞中（見中插彩版圖4）。

4.3 PCV-2免疫熒光檢測(cè)結(jié)果 選取的部位是脾臟，PCV-2陽性信號(hào)是綠色（FITC）（見中插彩版圖5）。巨噬細(xì)胞陽性信號(hào)是紅色（Ts Red）（見中插彩版圖6）。

5 討論

目前，PCV-2及相關(guān)疾病已在世界范圍內(nèi)發(fā)生并廣泛流行，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。盡管對(duì)PCV-2的研究已經(jīng)有很大的進(jìn)展，但是其致病機(jī)制不是十分明確。PCV-2感染引起機(jī)體的免疫抑制，并與其他病原共同感染，加重疾病的危害性，但其具體機(jī)制尚不清楚，對(duì)于這些問題，我們都必須對(duì)病毒在體內(nèi)和體外細(xì)胞中的膚質(zhì)及其對(duì)免疫系統(tǒng)的影響、宿主的抗病病毒免疫反應(yīng)及病毒蛋白對(duì)免疫功能的影響等進(jìn)行深入研究[3]。

本試驗(yàn)使用PCR、IHC-P與IFA法檢測(cè)PCV-2病毒抗原，其中IHC方法結(jié)果顯示，陽性細(xì)胞主要位于感染細(xì)胞的胞質(zhì)中，少數(shù)出現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi)。這與唐寧等檢測(cè)結(jié)果一致[4]。其中Allan等對(duì)荷蘭2群豬血清學(xué)調(diào)查表明，仔豬抗PCV-2母源抗體在出生后8～9周齡消失，在12～15周齡時(shí)血清抗體重新出現(xiàn)，說明仔豬在11～13周齡受到PCV-2感染[5]。

PCV-2的剖檢病理變化時(shí)肺臟出現(xiàn)非塌陷性、肝色樣變區(qū)或?qū)嵶?，淋巴結(jié)腫大，漿膜炎，腎臟有白斑，脾臟腫大或質(zhì)地變脆以及肝臟和腸道病變[6]。本試驗(yàn)通過PCR與IHC-P的方法，對(duì)豬圓環(huán)病毒進(jìn)行快速的診斷，免疫組化結(jié)果與病理學(xué)變化和PCR檢測(cè)基本相符。PCR診斷速度快，靈敏度高，成本價(jià)高，而免疫組化定位準(zhǔn)確，成本低。免疫熒光方法可準(zhǔn)確定位各種細(xì)胞。在臨床診斷中，如果只是對(duì)疾病確診，只需要采用PCR的方法。而如果想確定病毒感染的部位需要免疫組織化學(xué)的方法。如果要進(jìn)一步確定圓環(huán)病毒感染何種細(xì)胞，需要采取免疫熒光的方法。

[3] 婁忠子.豬圓環(huán)病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，30（6）：862-868.

[4] Kekarainen T，Montoya M，Dominguez J，et al.Porcine circovirus type2（PCV2）viral components immunomodulate recall antigen responses[J].Vet Immunol Immunopathol，2008，124（1-2）：41-49.

[5] 王李輝，趙明軍.豬免疫抑制性疾病致病機(jī)制研究進(jìn)展[J].豬業(yè)科學(xué)，2010，4：80-83.

[6]免疫組化法檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型在人工感染豬體內(nèi)的分布[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39（3）：372-375.

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