宋 珅，劉 琴，殷振雄，趙保堂，張 繼，2，*

（1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730070）

籽瓜，是一種潤(rùn)肺、暖胃的保健食品，富含果酸、核黃酸、尼可酸等18種氨基酸、維生素及多種微量元素，具有利尿、潤(rùn)肺、健脾的功效，對(duì)糖尿病、肥胖癥也有輔助醫(yī)療作用，籽瓜入藥可作“白虎湯”藥引[1-3]。劉長(zhǎng)綴等[4]利用籽瓜瓤為原料，開(kāi)發(fā)出一系列具有減肥降脂功效的籽瓜保健產(chǎn)品。王翠平[5]對(duì)籽瓜皮和瓢作了研究，表明籽瓜皮和籽瓜瓤具有一定的的清除DPPH·、OH·、ABTS·自由基能力和抑制肝癌細(xì)胞7721生長(zhǎng)的活性，可以作為一種良好的天然抗氧化劑及抗腫瘤活性物質(zhì)。多糖是一種具有多種功能的生物活性物質(zhì)，研究結(jié)果表明，不同植物的多糖，具有不同的功能，如抗癌、防癌、抗病毒、抗衰老、降血糖、降血脂、抑菌等[6]。而現(xiàn)今對(duì)籽瓜的利用僅限于瓜子的生產(chǎn)，瓜瓤含有豐富的多糖[7]，目前沒(méi)有人對(duì)籽瓜瓤的多糖進(jìn)行研究。鑒于對(duì)籽瓜多糖的提取和研究還未見(jiàn)報(bào)道，本文研究了籽瓜瓜瓤中籽瓜多糖的提取工藝、分子量以及抗氧化活性，是對(duì)籽瓜皮瓤的“廢物利用”，既解決了籽瓜去籽后產(chǎn)生污染問(wèn)題，又提高了籽瓜的經(jīng)濟(jì)效益和附加值，是籽瓜綜合利用的有效途徑之一，有很好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[8]，可為籽瓜的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

籽瓜 產(chǎn)自甘肅省白銀市靖遠(yuǎn)縣，新鮮籽瓜去皮去瓜子后，切碎，勻漿機(jī)6000r/min粉碎成汁，待用；氯仿（分析純） 忠義化工；溴化鉀（分析純） 鄭州雙騰化工；K2SO4（分析純） 禾泰化工有限公司；NaOH（分析純） 天津凱信化工有限公司；H2O2（分析純） 天津福辰化工；無(wú)水乙醇 天津精細(xì)化工廠；HCl（分析純） 西安化學(xué)試劑廠；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、四唑氮藍(lán)（NBT）、還原型輔酶Ⅰ鈉鹽（NADH）、吩嗪硫酸甲酯（PMS） 美國(guó)Sigma；水楊酸（分析純） 煙臺(tái)雙雙化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸（分析純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；K2HPO4、KH2PO4（分析純） 上?；瘜W(xué)試劑二廠；鐵氰化鉀（分析純） 西安化學(xué)試劑廠。

BL320H型電子天平 日本島津；JRA-6型數(shù)顯磁力攪拌水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；FSH-2A型可調(diào)高速分散器 常州華冠儀器制造有限公司；KQ-400GKDV型實(shí)驗(yàn)用超聲儀 常州諾基儀器有限公司；TDL5M型臺(tái)式大容量冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)廠；LGJ-185型真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；SB-35型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本EYELA；UV1000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) Labtech；IS10型傅立葉紅外光譜儀 美國(guó)Thermo；多角度激光光散射儀（λ=690nm，DAWN EOS，Wyatt Technology Co，） USA。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超聲波輔助提取籽瓜多糖的工藝 取一定量預(yù)處理后的籽瓜汁，以蒸餾水為溶劑，用KQ-400GKDV型實(shí)驗(yàn)用超聲儀，恒定超聲波功率為250W，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的溫度和時(shí)間等條件下提取籽瓜多糖。提取液4000r/min離心10min，上清60℃減壓濃縮至20mL，加入無(wú)水乙醇80mL，醇沉24h 5000r/min離心10min，取下層沉淀，-60℃冷凍干燥得到籽瓜粗多糖。籽瓜粗多糖經(jīng)木瓜蛋白酶和Sevage偶聯(lián)法脫去蛋白，60℃減壓濃縮至10mL，加入無(wú)水乙醇40mL，醇沉24h，5000r/min離心10min，取下層沉淀，-60℃冷凍干燥得到籽瓜多糖。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 固定條件液料比為1∶1（mL/g），提取溫度為60℃，提取時(shí)間為60min，研究液料比1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、3∶2（mL/g），提取溫度20、30、40、50、60、70℃，提取時(shí)間15、30、60、90、120min對(duì)籽瓜多糖的得率的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以確定提取時(shí)間、提取溫度及液料比的最佳工藝，以多糖得率為指標(biāo)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素、水平及編碼Table 1 Experiment factors，levels and code

1.2.4 分子量的測(cè)定 采用體積排阻色譜-光散射聯(lián)用（SEC-LLS）進(jìn)行測(cè)定。多角度激光光散射儀λ= 690nm，校準(zhǔn)常數(shù)=8.8500e-6；色譜柱型號(hào)為7.8mm× 300mm；溶劑為水。

1.2.5 多糖得率的計(jì)算 采用苯酚硫酸法測(cè)定總糖含量[9]。多糖得率計(jì)算公式如下：

1.2.6 籽瓜多糖的紅外光譜分析 充分干燥的籽瓜多糖樣品用KBr壓片，400～4000cm-1波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，掃描次數(shù)16次，分辨率為4cm-1。

1.3 籽瓜多糖的抗氧化活性研究

1.3.1 對(duì)DPPH自由基的清除作用 將1mL不同質(zhì)量濃度（0.02～2mg/mL）的多糖溶液、2mL DPPH（現(xiàn)用現(xiàn)配）溶液、2mL甲醇溶液充分混合均勻后在黑暗中靜置30min，在517nm處測(cè)定吸光值。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)樣品重復(fù)三次，求平均值。DPPH自由基清除率公式如下：

式中：A0表示無(wú)樣品的DPPH溶液的吸光值；Ai表示待測(cè)樣與DPPH混合溶液的吸光值；Aj表示不加DPPH的樣品的吸光值。

1.3.2 對(duì)羥基（·OH）自由基的清除作用 將多糖溶于去離子水中，配制終濃度為0.02～2mg/mL的多糖溶液。將2mL的多糖溶液、2mL 6mmol/L的FeSO4溶液、H2O2溶液混勻后靜置10min，再加入2mL 6mmol/L的水楊酸溶液，混勻，靜置30min后，在510nm處測(cè)定吸光值。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照組。每個(gè)樣品重復(fù)三次，求平均值?！H清除率計(jì)算公式如下：

式中：A0表示無(wú)樣品的混合反應(yīng)液的吸光值；Ai表示待測(cè)樣與混合反應(yīng)液的吸光值；Aj表示不加水楊酸的樣品溶液的吸光值。

1.3.3 對(duì)超氧陰離子（O2-·）的清除作用 PMS/NADH體系會(huì)產(chǎn)生超氧自由基，用NBT顯色法測(cè)定。將多糖溶于去離子水中，使終濃度達(dá)0.02～2mg/mL。反應(yīng)混合物中依次加入不同濃度的多糖溶液，Tris-HCl（16mmol/L，pH8.0），NADH（557μmol/L），NBT（108μmol/L）和PMS（45μmol/L），在25℃溫浴5min，在560nm下測(cè)吸光值。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照組。每個(gè)樣品重復(fù)三次，求平均值。O2-·清除率公式如下：

式中：A0表示無(wú)樣品的混合反應(yīng)液的吸光值；Ai表示待測(cè)樣與混合反應(yīng)液的吸光值。1.3.4 還原力的測(cè)定 不同濃度的多糖溶液（0.02～ 2mg/mL）1mL、2.5mL 0.2mol/L磷酸緩沖液（pH6.6）、2.5mL鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）溶液（1%）混合均勻，50℃水浴20min。加入的三氯乙酸溶液（10%）終止反應(yīng)。加入蒸餾水和氯化鐵（0.1%）混合均勻。在700nm下測(cè)吸光值。吸光值越高表示還原力越強(qiáng)。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)籽瓜多糖得率的影響 由圖1可知，在一定范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，籽瓜多糖的得率先增大后減小，在60min時(shí)達(dá)到最大。這是由于超聲波的空化效應(yīng)增大了溶劑進(jìn)入溶質(zhì)內(nèi)部的能力，使得多糖更容易從細(xì)胞中釋放出來(lái)，使得整個(gè)提取時(shí)間縮短，提取率增高。處理時(shí)間短，多糖溶解不充分；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)造成多糖降解，甚至使其中的五碳環(huán)或六碳環(huán)裂解而轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苡谝掖嫉膯翁?、寡糖或低聚糖，在醇沉過(guò)程中有所損失，最終會(huì)導(dǎo)致提取率的下降[10]。因此確定提取時(shí)間為60min。

圖1 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.1 The effect of extract times on the yield of polysaccharide

圖2 提取溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharide

2.1.2 提取溫度對(duì)籽瓜多糖得率的影響 由圖2可知，溫度對(duì)于籽瓜多糖的得率有著顯著的影響。隨著溫度的增加，籽瓜多糖得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，在20～60℃時(shí)，籽瓜多糖得率隨溫度的增加而增加，并且多糖得率在60℃時(shí)達(dá)到最大，在一定范圍里，提取溫度升高，有利于分子的運(yùn)動(dòng)和多糖的溶出；但溫度過(guò)高則會(huì)影響到多糖的結(jié)構(gòu)，反而會(huì)使多糖得率降低。因此最終確定適宜的提取溫度是60℃。

2.1.3 料液比對(duì)籽瓜多糖得率的影響 由圖3可知，隨料液比的增加，籽瓜多糖得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。這是因?yàn)?，料液比低時(shí)，多糖溶解不充分，得率低；隨著料液比增大，多糖充分溶脹，有利于多糖的溶出，使得率增加。但是，料液比過(guò)大，使后續(xù)提取過(guò)程中的濃縮時(shí)間增加，必然使多糖在濃縮過(guò)程中有較多損失，反而使多糖得率下降[11]。由圖3可知，料液比在1∶2時(shí)，籽瓜多糖得率最佳，料液比可確定為1∶2。

圖3 料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.3 The effect of ratio of material on the yield of polysaccharide

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取籽瓜多糖的工藝

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 RSM design matrix and the responses

以籽瓜多糖得率為響應(yīng)值Y，通過(guò)SAS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)資料進(jìn)行響應(yīng)面分析，共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)為零點(diǎn)，析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，其中零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用以估算實(shí)驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，經(jīng)二次回歸擬合后求得響應(yīng)函數(shù)，得到的回歸方程如下：

方差分析見(jiàn)表3。模型誤差顯著，失擬誤差不顯著，回歸系數(shù)R2為0.9861，說(shuō)明模型的擬合度很好，響應(yīng)值的98.61%的是由于所選變量引起的，決定系數(shù)（R2adj=0.9683）接近于1，變異系數(shù)（C.V.=2.29%）很低，都說(shuō)明模型相關(guān)性高，用該模型模擬真實(shí)的三因素三水平的分析是可行的[12]?？梢杂迷撃Ｐ头匠虂?lái)分析和預(yù)測(cè)不同提取條件下籽瓜多糖的得率的變化。

表3 多糖得率回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 3 Regression coefficient and ANOVA test of the yield of polysaccharide

由表3的分析結(jié)果可以看出三個(gè)因素對(duì)多糖得率影響的主次是X1＞X2＞X3，一次項(xiàng)X1、X2，二次項(xiàng)X12、X22、X32和交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3都是極顯著的，X3為顯著，表明各因素不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，且對(duì)響應(yīng)值的影響有明顯的交互作用。

2.2.1 響應(yīng)面結(jié)果分析 根據(jù)多糖得率Y的回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)面圖4～圖6。

圖4顯示的是提取溫度與提取時(shí)間對(duì)籽瓜多糖得率的影響。當(dāng)料液比為1∶1.72時(shí)，隨著溫度的升高，多糖得率呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，提取時(shí)間越長(zhǎng)得率越高，在料液比為1∶1.72，提取時(shí)間為85.18min，提取溫度為49.34℃條件下，多糖得率達(dá)到最大（4.132%）。

圖5顯示的是提取溫度為49.34℃條件下，料液比與提取時(shí)間的交互作用對(duì)多糖得率的影響?？梢钥闯鲎压隙嗵堑寐势鸪蹼S著料液比和提取時(shí)間的增大而增加。當(dāng)提取時(shí)間在85.18min內(nèi)，多糖得率成指數(shù)增加，然而料液比對(duì)多糖得率的增加影響較小。

圖6顯示料液比與溫度的相互作用較強(qiáng)，當(dāng)提取時(shí)間為85.18min時(shí)，隨著溫度的升高、料液比的增加，多糖得率呈先升高后降低的趨勢(shì)，在此條件下，料液比1∶1.72、溫度49.34℃，多糖得率最高。

圖4 溫度、時(shí)間及其交互作用對(duì)得率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plot of the combined effects of temperature and time on the yield of polysaccharide

圖5 時(shí)間、料液比及其交互作用對(duì)得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot and contour plot of the combined effects of time and ratio of material on the yield of polysaccharide

圖6 溫度、料液比及其交互作用對(duì)得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot of the combined effects of temperature and ratio of material on the yield of polysaccharide

2.2.2 優(yōu)化提取參數(shù)和驗(yàn)證模型 由SAS分析得到籽瓜多糖的最佳提取條件為：超聲波作用時(shí)間為85.18min，溫度為49.34℃，料液比為1∶1.72（g/mL），理論最佳提取率為4.132%。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可行性，采用得到的最佳提取條件進(jìn)行籽瓜多糖超聲波輔助提取的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作和生產(chǎn)的便利，因此將超聲波輔助提取籽瓜多糖的各個(gè)實(shí)驗(yàn)因素條件修訂為：時(shí)間為85min，溫度為49℃，料液比為1∶1.7（g/mL）。經(jīng)過(guò)5次平行實(shí)驗(yàn)，得到的平均得率為4.128%。

表4 最優(yōu)條件與最優(yōu)條件下的預(yù)測(cè)、實(shí)際值Table 4 Optimum conditions and the predicted and experimental value of response at the optimum conditions

2.3 籽瓜多糖的分子量測(cè)定

圖7 籽瓜多糖的SEC-LLS檢測(cè)結(jié)果圖Fig.7 The result of SWP determined by SEC-LLS

籽瓜多糖的SEC-LLS色譜圖如圖7所示。色譜圖顯示單一峰值，表明樣品的均勻性[13]。運(yùn)用超聲波輔助法提取的籽瓜多糖的分子量通過(guò)SEC-LLS最終確定為：重均分子量Mw=1.213×107，數(shù)均分子量為Mn= 1.089×106g/mol，分子量分布指數(shù)為Mw/Mn=11.136，表明分子量分布比較寬。

2.4 籽瓜多糖的紅外光譜分析

圖8 籽瓜多糖的紅外圖譜Fig.8 FTIR spectra of Seed Watermelon polysaccharide

圖8顯示的是碳水化合物的光吸收特征。3422cm-1處為-OH伸縮振動(dòng)峰，而2921cm-1和1419cm-1處的2組吸收峰分別代表了C-H的伸縮振動(dòng)和變角振動(dòng)，基本可以確認(rèn)籽瓜多糖是糖類化合物[14]。1642.77cm-1處的吸收峰可能是-CHO中C=O的伸縮振動(dòng)。1046.28cm-1處的吸收峰為C-O-H中的-OH的變角振動(dòng)[15]。

2.5 籽瓜多糖的體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

2.5.1 對(duì)DPPH自由基的清除作用 以抗壞血酸作對(duì)照，考察了籽瓜多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用，結(jié)果如圖9所示，與VC一樣，籽瓜多糖對(duì)DPPH自由基的清除率隨著濃度的增大而增強(qiáng)，存在濃度依賴性；當(dāng)籽瓜多糖的濃度在0.01～0.32mg/mL的范圍內(nèi)，籽瓜多糖對(duì)DPPH自由基的清除率明顯高于VC。籽瓜多糖濃度為1～5mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)到68%。

圖9 籽瓜多糖與VC對(duì)DPPH·自由基的清除能力比較Fig.9 Comparison of DPPH radical scavenging ability of SWP and VC

2.5.2 對(duì)羥基（·OH）自由基的清除作用 以抗壞血酸作對(duì)照，考察籽瓜多糖對(duì)羥基（·OH）自由基的清除作用，結(jié)果如圖10所示。在所選濃度范圍內(nèi)，籽瓜多糖對(duì)羥基（·OH）自由基的清除率隨著濃度的增大而增強(qiáng)，存在濃度依賴性，在濃度為5mg/mL時(shí)，籽瓜多糖的清除率達(dá)到75.35%。

圖10 籽瓜多糖與VC對(duì)羥自由基的清除能力比較Fig.10 Comparison of hydroxyl radical scavenging ability of SWP and VC

2.5.3 對(duì)超氧陰離子（O2-·）的清除作用 以抗壞血酸作對(duì)照，考察籽瓜多糖對(duì)超氧陰離子（O2-·）的清除作用，結(jié)果如圖11所示。在所選濃度范圍內(nèi)，籽瓜多糖對(duì)超氧陰離子（O2-·）的清除率隨濃度的增加而增大。在濃度為5mg/mL時(shí)，籽瓜多糖對(duì)超氧陰離子清除率達(dá)到50%。

2.5.4 還原力 抗氧化劑的還原力與其抗氧化性之間存在一定的關(guān)系，抗氧化劑是通過(guò)自身的還原作用給出電子而清除自由基，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。因此，可通過(guò)測(cè)定還原力來(lái)說(shuō)明其抗氧化活性的大小。從圖12可以看出，與VC相比，籽瓜多糖的還原力相對(duì)較弱，隨著籽瓜多糖質(zhì)量濃度的增加，其總還原力也逐漸增加，總體上呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。

圖11 籽瓜多糖與VC對(duì)超氧自由基的清除能力比較Fig.11 Comparison of Superoxide radical scavenging ability of SWP and VC

圖12 籽瓜多糖與VC的還原力比較Fig.12 Comparison of of reducing power SWP and VC

3 結(jié)論

通過(guò)超聲波輔助提取法提取籽瓜多糖，基于單因素實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)籽瓜多糖提取時(shí)間、提取溫度、料液比等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到超聲波輔助提取籽瓜多糖的最佳工藝條件為：時(shí)間為85min，溫度為49℃，料液比為1∶1.7（g/mL）。在此條件下，籽瓜多糖的實(shí)際得率為4.128%，與預(yù)測(cè)值很接近。采用體積排阻色譜-光散射聯(lián)用（SEC-LLS）測(cè)得籽瓜多糖的分子量為Mn=1.089×106g/moL?？寡趸u(píng)價(jià)結(jié)果顯示，籽瓜多糖有顯著的體外抗氧化活性，可以作為一種潛在的抗氧化劑應(yīng)用于食品體系中，但籽瓜多糖可能的抗氧化機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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