龔永謙 ,鄭家法 ,簡(jiǎn)唯求

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科,湖南衡陽421001;2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院耳鼻咽喉科)

復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要病理特征,是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。細(xì)胞角蛋白(CK)主要分布在上皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞起源的腫瘤,而在間葉組織中缺乏表達(dá),是一個(gè)很大的中間絲家族[1]。雖然CK是在腫瘤研究中得到廣泛應(yīng)用的標(biāo)志物[2]。但是目前CK8的功能及其結(jié)構(gòu)的改變對(duì)疾病的影響還沒很明確。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化方法檢測(cè)CK8在不同分化程度及有無伴淋巴組織轉(zhuǎn)移的喉鱗癌中的表達(dá),探討CK8在喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中的意義。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2008年1月～2012年1月在南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院及湖南省腫瘤醫(yī)院行喉鱗癌手術(shù)切除標(biāo)本78例,其中56例無淋巴組織轉(zhuǎn)移,22例伴有淋巴組織轉(zhuǎn)移。在無淋巴組織轉(zhuǎn)移喉鱗癌標(biāo)本中高分化16例、中分化18例、低分化22例,所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確診,病理診斷由至少2名以上副主任醫(yī)生確定,并選取經(jīng)病理檢查證實(shí)為喉息肉組織的12例標(biāo)本作為對(duì)照組。所有患者年齡在49～71歲,中位年齡60歲,男60例,女18例。所有患者術(shù)前均未做放療、化療等治療,也無內(nèi)分泌、免疫性等疾病。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用SP免疫組化方法：準(zhǔn)備厚約4 μm切片,烤干后用石蠟包埋備用。CK8單克隆抗體購自sigma公司,SP試劑盒購自北京中杉金橋公司。以PBS代替一抗做陰性對(duì)照,按SP試劑盒說明書操作。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

CK8的陽性表達(dá)部位為細(xì)胞質(zhì),呈棕黃色顆粒,隨機(jī)選取12個(gè)視野,每個(gè)視野至少觀察100個(gè)細(xì)胞,計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞,取其平均值。采用染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞含量?jī)烧呔C合計(jì)分[3]。其中染色強(qiáng)度計(jì)分：組織中無色計(jì)為0分,淺黃色計(jì)為1分,黃色計(jì)為2分,棕褐色計(jì)為3分;陽性細(xì)胞含量計(jì)分：≤20%計(jì)為1分;20% ～60%之間計(jì)為2分;≥60%計(jì)為3分。將染色數(shù)量及陽性細(xì)胞含量相加后,其中1分計(jì)為“-”;2～3分計(jì)為“+”,3～5分計(jì)為“++”≥5分計(jì)為“+++”。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Spss13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn),Fisher確切概率法及相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CK8在喉息肉和喉鱗癌組織中的表達(dá)

如圖1所示,CK8在喉息肉組織中無表達(dá);CK8主要在喉鱗癌組織中表達(dá),陽性細(xì)胞分布于粘膜各層,浸潤到粘膜下組織的鱗癌細(xì)胞也呈陽性染色。通過相對(duì)密度計(jì)算結(jié)果顯示,CK8在喉鱗癌組織組和喉息肉組之間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.554,P＜0.05)。

圖1 SP免疫組化法CK8在癌組織中的表達(dá)情況 A：CK8在喉息肉中無表達(dá),B：CK8在高分化喉鱗癌中的表達(dá),C：CK8在中分化喉鱗癌中的表達(dá),D：CK8在低分化喉鱗癌中的表達(dá),E：CK8在伴有淋巴組織轉(zhuǎn)移喉鱗癌中的表達(dá);F：CK8在喉鱗癌轉(zhuǎn)移淋巴組織中的表達(dá)

2.2 CK8在喉鱗癌及其轉(zhuǎn)移淋巴組織中的表達(dá)情況

方差和Fisher確切概率法分析結(jié)果顯示,在喉息肉、無淋巴組織轉(zhuǎn)移和有淋巴組織轉(zhuǎn)移喉鱗癌之間相比(χ2=18.693,P＜0.005),差異的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。CK8在無淋巴組織轉(zhuǎn)移和伴有淋巴組織轉(zhuǎn)移喉鱗癌組織中的陽性表達(dá)率分別為47.2%和77.3%。喉息肉組織與無淋巴轉(zhuǎn)移喉鱗癌組(χ2=7.161,P＜0.01)或伴有淋巴轉(zhuǎn)移喉鱗癌組(χ2=15.584,P＜0.005)之間,CK8表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;說明CK8與喉鱗癌發(fā)病明顯相關(guān);進(jìn)一步分析顯示,CK8表達(dá)在伴有淋巴組織轉(zhuǎn)移喉鱗癌與無淋巴組織轉(zhuǎn)移喉鱗癌組之間(χ2=4.892,P＜0.05)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明CK8表達(dá)增高也與喉鱗癌淋巴組織轉(zhuǎn)移有關(guān)。

在無淋巴轉(zhuǎn)移喉鱗癌組內(nèi),CK8在高、中、低三種不同分化程度喉鱗癌組織中表達(dá)率分別12.6%(2/16)、55.5%(10/18)和 63.6%(14/22),說明分化程度的降低,其表達(dá)率明顯增高。經(jīng)χ2檢測(cè)和Fisher確切概率法比較,高分化組與中分化組之間(χ2=5.119,P＜0.05),高分化組與低化化組之間(χ2=7.949,P＜0.05),CK8差異表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但在中分化組與低分化組之間(χ2=0.038,P＞0.05),CK8差異表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在伴有淋巴組織轉(zhuǎn)移喉鱗癌中,分別檢測(cè)喉鱗癌組織和淋巴組織,其表達(dá)率分別為77.3%(5/17)和90.9%(2/20)。CK8差異表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.679,P＞0.05)。

表1 CK8在喉息肉、無淋巴組織轉(zhuǎn)移喉鱗癌及伴有淋巴組織轉(zhuǎn)移喉鱗癌中的表達(dá)情況

3 討 論

喉癌是耳鼻咽喉頭頸外科常見的惡性腫瘤,其中鱗狀細(xì)胞癌是喉癌的主要病理類型[4]。喉部解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜,病情隱蔽,其血供、淋巴豐富,因此在臨床上患者確診為喉癌時(shí)約半數(shù)已是臨床中晚期,且多伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。頸淋巴結(jié)清掃術(shù)是目前喉鱗癌晚期可靠的手術(shù)方式,因此了解頸部淋巴結(jié)是否有轉(zhuǎn)移有助于了解腫瘤的預(yù)后和預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)。喉癌的病因目前尚不清楚,研究表明是多種致癌因素協(xié)同作用的結(jié)果,隨著臨床研究的發(fā)展,儲(chǔ)備細(xì)胞的作用已經(jīng)受到科學(xué)家們的重視。研究顯示,儲(chǔ)備細(xì)胞是人乳頭瘤病毒(HPV)感染的靶細(xì)胞[5]。HPV感染引發(fā)的喉乳頭狀瘤是喉癌的癌前研究,當(dāng)受到過度刺激或環(huán)境因素的影響時(shí),這些細(xì)胞就會(huì)發(fā)生化生,向癌細(xì)胞發(fā)展。而CK8為儲(chǔ)備細(xì)胞的分子標(biāo)志物[6]。CK8具有泛素化特征,與癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),促進(jìn)上皮源性腫瘤發(fā)生。有研究顯示,在大多數(shù)無淋巴組織轉(zhuǎn)移的喉癌和伴有淋巴組織轉(zhuǎn)移喉癌組織中均存在CK-8蛋白的高表達(dá)[7]。因此研究CK8可能對(duì)喉鱗癌的早期診斷、預(yù)測(cè)是否有淋巴組織轉(zhuǎn)移及其預(yù)后有重要的意義。

CK蛋白是酶類的一種,是通過蛋白磷酸化來調(diào)控細(xì)胞的生長,也是上皮細(xì)胞分化的標(biāo)志,分為酸性(Ⅰ型)和堿性(Ⅱ型)細(xì)胞角蛋白兩個(gè)亞家庭[8]。CK8屬于Ⅱ型CK,Mr約為54000.編碼483個(gè)氨基酸。在多種疾病狀態(tài)下,CK蛋白表達(dá)模式可隨細(xì)胞分化或增殖而改變[9]。

為了進(jìn)一步證實(shí)CK8在喉鱗癌中的表達(dá)與意義,本實(shí)驗(yàn)分別采用喉息肉,無淋巴組織轉(zhuǎn)移喉鱗癌組織和伴有淋巴組織轉(zhuǎn)移喉鱗癌組織,經(jīng)過檢測(cè)CK8的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CK8在喉息肉組織不表達(dá),在喉癌組織中,隨著喉鱗癌組織惡性程度增高,CK8的陽性表達(dá)率也增高,在伴有淋巴轉(zhuǎn)移的喉鱗癌組織表達(dá)更加顯著,三者之間差異的表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明CK8的陽性率與喉鱗癌的分化程度相關(guān),但調(diào)控細(xì)胞角蛋白表達(dá)機(jī)制尚不清楚,仍需進(jìn)一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)CK8在伴有淋巴轉(zhuǎn)移喉鱗癌中的表達(dá)率明顯高于無淋巴轉(zhuǎn)移喉鱗癌。這說明CK8的陽性表達(dá)率與淋巴組織轉(zhuǎn)移密切相關(guān),淋巴的轉(zhuǎn)移意味著喉鱗癌的進(jìn)一步發(fā)展。頭頸部解剖復(fù)雜,有豐富的血供和淋巴,更容易使喉鱗癌轉(zhuǎn)移到其他組織或器官。由此可以認(rèn)為,通過檢測(cè)喉癌組織中CK8的表達(dá)情況,可能預(yù)測(cè)喉鱗癌發(fā)生發(fā)展趨勢(shì)及預(yù)后情況。因此在喉鱗癌中CK8的表達(dá)越明顯,提示喉鱗癌發(fā)生淋巴組織轉(zhuǎn)移的概率可能性越大,且預(yù)后差。同時(shí)隨著研究的不斷深入,CK8可能成為喉鱗癌臨床治療的靶點(diǎn),也可作為喉鱗癌診斷及預(yù)測(cè)病變進(jìn)展趨勢(shì)的標(biāo)志物,也可通過淋巴組織檢測(cè)來作為患者預(yù)后評(píng)價(jià)的參考指標(biāo)。

[1]Aslam MB,Sahasrabudhe N.Cytokeratin(CK7 and CK20)switching in the natural history of pulmonary small cell carcinoma：an interesting but unpublished phenomenon[J].J Clin Pathol,2011,64(4)：367-368.

[2]初培國.細(xì)胞角蛋白染色在腫瘤診斷中的應(yīng)用[J].中華病理學(xué)雜志,2004,33(3)：273-276.

[3]張志偉,湯國輝,趙強(qiáng),等.AKT-p27Kip1-Cyclin E在胃癌組織中的表達(dá)及意義[J].世界華人消化雜志,2011,19(21)：2233-2240.

[4]Sanderson RJ,Ironside JAD.Squamous cell carcinoma of the head and neck[J].BMJ,2002,325(7368)：822-827.

[5]Martens JE,Arends J,Van der Linden PJ,et al.Cytokeratin 17 and p63 are markers of the HPV target cell,the cervical stem cell[J].Anticancer Res,2004,24(2)：771.

[6]Ikeda K,Tate G,Suzuki T,et al.Coordinate expression of cy-tokeratin 8 and cytokeratin 17 immunohistochemical staining in cervical intraepithelial neoplasia and cervical squamous cell carcinoma：An immunohistochemical analysis and review of the literature[J].Gynecologic Oncology,2008,108(3)：598.

[7]Wang Y,He QY,Tsao SW,et al.Cytokeratin 8 silencing inhuman nasopharyngeal carcinoma cells leads to cisplatin sensitization[J].Cancer Lett,2008,265(2)：188-196.

[8]Yang XR,Xu Y,Shi GM,et al.Cytokeratin 10 and cytokeratin19：predictive markers for poor prognosis in hepatocellular carcinoma patients after curative resection[J].Clin Cancer Res,2008,14(12)：3850-3859.

[9]He T,Stepulak A,Holmstrom TH,et al.The intermediate tilament protein keratin 8 is a novel cytoplasmic substrate for c-Jun N-terminal kinase[J].J Biol Chem,2002,277(13)：10767-10774.