殷潤婷，張偉，奚濤

（1.南通大學醫(yī)學院藥理系，江蘇 南通226001；2.中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇 南京210009）

·藥學研究· PHARMACEUTICAL RESEARCH

改良的人乳腺癌細胞三維培養(yǎng)模型及藥敏性考察

殷潤婷1,2，張偉1*，奚濤2**

（1.南通大學醫(yī)學院藥理系，江蘇 南通226001；2.中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇 南京210009）

目的：建立適用于高通量藥物篩選的人乳腺癌MCF-7細胞三維培養(yǎng)模型，考察其藥敏性。方法：在傳統(tǒng)的liquidoverlay法和直接混合法基礎上，建立新型錨定法，制備MCF-7細胞的三維培養(yǎng)系統(tǒng)；以二維培養(yǎng)和直接混合法制備的三維培養(yǎng)系統(tǒng)作對照，通過倒置顯微鏡觀察其中細胞形態(tài)學特征，繪制細胞生長曲線，使用順鉑并采用MTT法進行藥敏試驗。結果：采用新型錨定法成功制備MCF-7細胞的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，不同于二維培養(yǎng)系統(tǒng)，其中MCF-7細胞形成典型的直徑為160μm 左右的葡萄樣多細胞球；與直接混合法制備的三維培養(yǎng)系統(tǒng)相比，其中MCF-7細胞生長速度明顯更快（P＜0.05）；與二維培養(yǎng)系統(tǒng)相比，其中MCF-7細胞對順鉑的敏感性顯著降低，即順鉑對MCF-7細胞的增殖抑制率明顯降低（P＜0.01）。結論：該新型錨定法制備的乳腺癌細胞三維培養(yǎng)系統(tǒng)更接近體內(nèi)腫瘤生長環(huán)境，其中腫瘤細胞能模擬體內(nèi)實體瘤的耐藥特征，故其更適用于抗癌藥物的活性篩選。

人乳腺癌細胞；三維培養(yǎng)；錨定法；藥敏性

乳腺癌是女性發(fā)病率居首位的惡性腫瘤,在我國,女性乳腺癌發(fā)病率和死亡率也呈逐年遞增之勢,嚴重威脅著婦女的健康,且由于癌細胞在治療過程中易產(chǎn)生耐藥性,導致乳腺癌預后較差[1]。于是,藥物研究者一直在致力于研發(fā)能克服腫瘤耐藥并預防腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)的更為有效的抗乳腺癌藥物。抗腫瘤藥物的研發(fā)往往需要投入大量的經(jīng)費和資源,據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)統(tǒng)計,2000年在美國成功開發(fā)一個新藥需要投入約8.02億美元[2]?？墒?有許多候選藥物由于在動物或人體體內(nèi)試驗中所表現(xiàn)出的藥效遠不及體外模型實驗,導致在研發(fā)中途夭折,造成大量人力和物力的浪費。因此,亟待開發(fā)能很好模擬人體體內(nèi)環(huán)境且簡便、重復性好的體外模型,用于抗癌藥物的研究與開發(fā)。

二維(2D)單層細胞培養(yǎng)是常用的體外模型,但其并不能模擬出腫瘤細胞在體內(nèi)所處的三維(3D)環(huán)境,且易導致細胞失去體內(nèi)環(huán)境下所具有的特征[3]。為了改進2D培養(yǎng)方法,研究人員對單層培養(yǎng)細胞進行多層覆蓋,但這種“三明治”式的培養(yǎng)方法與體內(nèi)的3D環(huán)境還是存在很大差距,如體內(nèi)腫瘤細胞所呈現(xiàn)的多細胞球體(MCS)形態(tài)能相互聯(lián)系、氧氣的組織滲透受限導致缺氧環(huán)境以及腫瘤易于產(chǎn)生耐藥性,而這些都是多層細胞培養(yǎng)方式無法模擬的。所以,需要開發(fā)一種更接近實體瘤3D結構的培養(yǎng)方式即3D細胞培養(yǎng)系統(tǒng),作為藥物研究的平臺[4]。采用不同的3D支架進行細胞培養(yǎng),形成的MCS能模擬體內(nèi)實體瘤的生長環(huán)境,如養(yǎng)分和氣體濃度在培養(yǎng)物中呈梯度變化,而存在的缺氧環(huán)境能誘導細胞分化,并刺激其增殖[3-5]。且3D培養(yǎng)的腫瘤細胞能模擬體內(nèi)實體瘤的耐藥特征。本文基于Liquidoverlay法及直接混合法建立改良的新型錨定法,制備人乳腺癌細胞MCF-7的3D培養(yǎng)系統(tǒng),考察其中細胞的形態(tài)學和生長曲線,并對其藥敏性進行初步研究,為抗癌藥物活性篩選平臺的建立提供實驗依據(jù)。

1 材料

SPF級SD大鼠,由中國科學院上海實驗動物中心上海斯萊克實驗動物有限公司提供,動物合格證號:SCXK(滬)2007-0005;人乳腺癌MCF-7細胞株,由ATCC細胞庫提供,本實驗室保藏。胰蛋白酶(上海生工公司);DMEM 高糖型培養(yǎng)基,胎牛血清(FCS),均為美國Gibico公司產(chǎn)品;噻唑蘭(MTT),Ⅰ型膠原酶,均為美國Sigma公司產(chǎn)品;順鉑(DDP),由東南大學藥物研究中心提供。96孔培養(yǎng)板(美國BD公司);倒置顯微鏡(德國Leica公司)。

2 方法

2.1 膠原溶液的制備

參照文獻[6],將體質(zhì)量為200～250g的SD大鼠尾部剪下,浸入70mL·L-1乙醇溶液中,20min后,在無菌條件下抽出尾腱,并將其剪碎,置入0.5mL·L-1醋酸溶液中(每條鼠尾腱所用溶液約150mL),在4℃條件下不時攪拌,48h后,10000r·min-1離心1.5h,上清液用100g·L-1氯化鈉溶液鹽析,最后將沉淀的膠原蛋白溶于4℃的1mmoL·L-1鹽酸溶液中,即得膠原溶液。采用Lowry法測得該膠原溶液質(zhì)量濃度為5g·L-1,此可溶性鼠尾腱膠原的主要成分為Ⅰ型膠原。

2.2 三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的制備

用1.25g·L-1胰蛋白酶溶液消化指數(shù)生長期的MCF-7細胞,并調(diào)整細胞濃度為2×105·L-1,制得細胞懸液。4℃條件下,按體積比1∶1∶5∶2∶1,將10倍常規(guī)濃度的磷酸緩沖液(PBS)、FCS、2倍常規(guī)濃度的DMEM培養(yǎng)液、膠原溶液和雙蒸水快速混勻,再滴加氫氧化鈉溶液調(diào)pH為7,制成膠原培養(yǎng)液。采用對liquidoverlay法[7]及直接混合法進行改良后而建立的新型錨定法制備3D細胞培養(yǎng)系統(tǒng):將膠原培養(yǎng)液移入96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔50μL,于室溫放置15min,使之形成半凝固的錨定層,然后將膠原培養(yǎng)液和細胞懸液按體積比1∶1混合,加入有錨定層的孔中,室溫孵育15min,再于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min,使之完全凝固,得到細胞培養(yǎng)層,最后每孔加入100μL含10%FCS的DMEM完全培養(yǎng)基,形成覆蓋層,隔天換液1次,即可。參照文獻[8],采用直接混合法制備3D細胞培養(yǎng)系統(tǒng):將膠原培養(yǎng)液和細胞懸液按體積比1∶1混合,置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min,待凝固后,每孔加入100μL含10%FCS的DMEM 完全培養(yǎng)基覆蓋,隔天換液1次,即可。

2.3 考察指標

在3D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)建成后的0、2、4、6、8d時,分別考察如下指標:①細胞形態(tài)學,在倒置顯微鏡下觀察膠原凝膠塊中MCF-7細胞形態(tài)學的改變;②細胞生長曲線,將各時間點的膠原凝膠塊用4g·L-1Ⅰ型膠原酶溶液消化,制成細胞懸液,并置于血球計數(shù)板上,在倒置顯微鏡下進行細胞計數(shù),各培養(yǎng)系統(tǒng)于每個時間點設置5個復孔進行細胞計數(shù),試驗獨立重復3次,繪制細胞生長曲線。同時,各指標均以2D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)作對照。

2.4 藥敏試驗

在各細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中,當細胞進入對數(shù)生長期后,加入系列濃度的DDP,72h后,采用MTT法進行檢測:將5g·L-1MTT溶液加入DDP處理后的孔板中,置37℃培養(yǎng)箱中孵育4h,用酶標儀在490nm處測定其吸收值(OD值),計算細胞增殖抑制率(PI),各培養(yǎng)系統(tǒng)的每個濃度藥物組設置5個復孔進行測定,試驗獨立重復3次,繪制PI曲線。PI=[1-(ODtest/ODcontrol)] ×100%,其中,ODtest和ODcontrol分別為給藥組和未給藥的陰性對照組OD值。

2.5 統(tǒng)計學分析

試驗所測數(shù)據(jù)均以珋x±s表示,采用獨立樣本t檢驗。

3 結果

3.1 各培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞形態(tài)學比較

倒置顯微鏡下觀察顯示,兩種3D培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞在形態(tài)學上無差異,只是細胞數(shù)量上有差異,其中新型錨定法制備的3D培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞在生長過程中相互聚集并迅速增殖,形成細胞數(shù)目不等的葡萄樣多細胞聚集體,即MCS,符合MCF-7細胞經(jīng)3D培養(yǎng)后的典型生長特征[9],其間,MCS體積逐漸增大,其中細胞數(shù)目逐漸增多,于培養(yǎng)第6d時,大多數(shù)MCS直徑達到160μm左右;而2D培養(yǎng)系統(tǒng)中的細胞呈典型的多邊形扁平樣形態(tài)(見圖1)。

圖1 倒置顯微鏡下3D和2D培養(yǎng)系統(tǒng)中MCF-7細胞形態(tài)學特征(×400)Figure 1 Morphological charateristics of MCF-7 cells in 2D and 3D culture systems under inverted microscope

3.2 各培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞生長曲線比較

細胞生長曲線顯示,到第8d時,與直接混合法制備的3D培養(yǎng)系統(tǒng)相比,新型錨定法制備的3D培養(yǎng)系統(tǒng)和2D培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞計數(shù)明顯更多(P＜0.05和P＜0.01),細胞增殖速率顯著加快(見圖2)。表明,與直接混合法相比,新型錨定法制備的3D培養(yǎng)系統(tǒng)更適合細胞生長。

圖2 各培養(yǎng)系統(tǒng)中MCF-7細胞生長曲線Figure 2 Growth curves of MCF-7 cells in different culture systems

3.3 各培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞藥敏性差異

MTT實驗顯示,與2D培養(yǎng)系統(tǒng)相比,新型錨定法制備的3D培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞對各濃度DDP的敏感性均顯著降低,尤其對高濃度DDP(P＜0.01);且DDP對3D和2D培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞的PI值均隨濃度增大而明顯提高,即各培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞對DDP的敏感性具濃度依賴性(見圖3)。

圖3 DDP對各培養(yǎng)系統(tǒng)中MCF-7細胞的PI曲線和回歸曲線Figure 3 PI curves and regression curves of MCF-7 cells in different culture by DDP

4 討論

細胞的體外3D培養(yǎng)系統(tǒng)彌補了2D培養(yǎng)系統(tǒng)難以模擬的細胞間以及細胞與基質(zhì)間的相互作用,能更真實地模擬體內(nèi)腫瘤瘤體的結構形態(tài)及細胞分化功能,使其對藥物治療的反應更接近體內(nèi)的真實情況[10-11],目前已成為腫瘤研究以及藥物開發(fā)的有力工具,尤其在體內(nèi)腫瘤耐藥性研究方面顯示出獨特優(yōu)勢[12]。此外,體外3D細胞培養(yǎng)模型可控性較好,與體內(nèi)模型相比,能節(jié)省試驗成本,且其試驗結果的平行性和重現(xiàn)性較好,因此在抗癌藥物藥效評價方法研究方面具有巨大的應用潛力。

3D培養(yǎng)支架材料的選擇是成功進行細胞3D培養(yǎng)的關鍵步驟之一。第1代的3D培養(yǎng)系統(tǒng)運用了人工合成的生物高分子微纖維支架,材料包括聚乳酸羥基乙酸-殼多糖等,但這些材料的降解產(chǎn)物對細胞的生長與代謝都有不同程度的影響,從而影響試驗結果的真實性。目前,用于3D培養(yǎng)支架的新型人工合成材料仍在研發(fā)中。于是,人們考慮到使用更接近體內(nèi)細胞外基質(zhì)(ECM)的材料,如ECM的主要成分膠原蛋白作為細胞培養(yǎng)支架,尤其是商業(yè)化的基質(zhì)膠產(chǎn)品Matrigel和鼠尾Ⅰ型膠原的應用最為廣泛[13]?？鼓[瘤藥物的研發(fā)往往需要進行高通量篩選,而Matrigel價格昂貴,所以經(jīng)濟且制備簡單的Ⅰ型膠原成為目前3D培養(yǎng)支架的首選材料。Ⅰ型膠原蛋白溶液可使用醋酸或稀鹽酸溶液來制備,但研究發(fā)現(xiàn),用醋酸溶液制備的膠原溶液在中和過程中會產(chǎn)生醋酸鈉鹽,而該鹽對細胞增殖有很大影響[14],因此,本文采用稀鹽酸制備膠原蛋白溶液。

常見的膠原3D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)制備方法大多是采用直接混合法,即將膠原培養(yǎng)液與細胞懸液直接混合而形成細胞培養(yǎng)凝膠,可是細胞在膠原凝固過程中會產(chǎn)生自然沉降,從而影響其在膠原中的均勻分布;而且,長時間的孵育會使膠原在細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生脫水收縮,甚至會從培養(yǎng)支持物上脫離,對細胞產(chǎn)生機械應力,影響細胞生長[15]。此外,Raub等[16]在對膠原蛋白凝固條件進行研究時發(fā)現(xiàn),膠原蛋白凝膠溶液的pH值、孵育溫度及鹽離子濃度均會對膠原蛋白單體聚合成膠原纖維產(chǎn)生很大影響。而Sung等[17]則發(fā)現(xiàn),在膠原凝膠凝固過程中,進行低溫預處理,可使膠原纖維排列更加有序,且形成的纖維更厚,有利于細胞生長?；谝陨涎芯拷Y果,本文通過優(yōu)化的膠原凝膠化條件,并對liquidoverlay法和直接混合法進行改良,建立了制備膠原3D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的方法— —新型錨定法。MCF-7細胞生長曲線的測定結果表明,與直接混合法相比,該方法制備膠原3D培養(yǎng)系統(tǒng)能夠降低細胞在凝膠中沉降而帶來的影響,更適合細胞的生長,可提高細胞的生長密度,形成的MCS也比較均一。況且,與liquidoverlay法相比,該方法省略了細胞聚集步驟,更加簡便,適用于抗癌藥物的高通量篩選。

已有研究表明,3D培養(yǎng)的腫瘤細胞株所具有的耐藥特征與體內(nèi)實體瘤相近,均表現(xiàn)為對多種化療藥物不敏感,但當3D培養(yǎng)的腫瘤細胞被消化分散后,其對藥物的敏感性明顯提高。如,Graham等[18]研究發(fā)現(xiàn),3D培養(yǎng)的小鼠乳腺癌細胞EMT6具有耐藥性,而經(jīng)2D培養(yǎng)后其耐藥性完全消失。本試驗選擇人乳腺癌細胞MCF-7進行研究,采用MTT法檢測2D及3D培養(yǎng)MCF-7細胞的藥物敏感性。以往人們在考察3D培養(yǎng)的細胞生長情況時采用的染色細胞計數(shù)方法大多存在操作繁瑣、耗時長、操作過程中易造成細胞死亡、且平行孔之間實驗結果的誤差較大等弊端,目前在利用3D培養(yǎng)細胞進行的藥物高通量篩選實驗中常用直接染色法進行細胞計數(shù),如CCK-8和Amarblue染色法[5]等。筆者在預實驗中發(fā)現(xiàn),MTT能很好地擴散進凝膠,復孔間平行性較好,且在藥敏試驗中陰性對照檢測的OD值在0.8左右,也說明細胞染色情況較好;此外,PI值是對比陰性對照組而得到的計算結果,MTT滲透率的影響可相互抵消。因此,本文在藥敏試驗中,嘗試采用更為經(jīng)濟和簡便的MTT法進行細胞計數(shù);而且,在之前檢測細胞生長曲線時發(fā)現(xiàn)更換培養(yǎng)基可促進腫瘤細胞的增殖,但在MTT實驗中為了減少操作誤差,沒有更換培養(yǎng)基,可是2D細胞培養(yǎng)孔在不更換培養(yǎng)基的情況下,其細胞培養(yǎng)只能維持72h,超過72h則會由于培養(yǎng)基養(yǎng)分耗竭、細胞代謝產(chǎn)物增加等因素導致細胞死亡,造成實驗誤差,而在培養(yǎng)24和48h時,由細胞生長曲線可知3D培養(yǎng)細胞還未進入指數(shù)生長期,細胞數(shù)量變化小,此時OD值并不能真實反映藥物的作用效果,于是選擇在加入DDP后培養(yǎng)72h時檢測細胞對DDP的敏感性。藥敏試驗結果表明,與2D培養(yǎng)系統(tǒng)相比,MCF-7細胞在3D培養(yǎng)條件下對DDP的敏感性顯著降低。這是由于,與2D培養(yǎng)系統(tǒng)相比,在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中,膠原蛋白凝膠能模擬體內(nèi)ECM環(huán)境,降低藥物擴散速度,而形成的多細胞球可增強細胞間相互作用,且該系統(tǒng)能模擬實體瘤獨特的微環(huán)境,如高滲缺氧等,從而致使其中細胞表現(xiàn)出對DDP的耐藥性。這與乳腺癌的臨床上顯示的耐藥特征較為接近,表明本文所建立的體外3D細胞培養(yǎng)模型用于模擬體內(nèi)乳腺癌是成功的,可用于抗腫瘤藥物活性的評價。不過,本文中發(fā)現(xiàn)的3D培養(yǎng)系統(tǒng)中乳腺癌細胞對DDP產(chǎn)生明顯耐藥性的相關機制尚有待進一步研究。

[參 考 文 獻]

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YIN Runting1,2, ZHANG Wei1, XI Tao2
(1.Department of Pharmacology, School of Medicine, Nantong University, Nantong 226001, China; 2.School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)

Objective:To establish a three-dimensional (3D) culture model of human breast cancer cell line MCF-7 for high throughout screening of anticancer agents and to investigate its drug sensitivity. Methods:Based on the conventional liquid overlay method and mixing method, the improved anchor method was established for the preparation of a new 3D culture system of MCF-7 cell line. Using a 2D culture system and a 3D culture system prepared by mixing method as control, the morphological characteristics of MCF-7 cells in the new 3D culture system were observed under inverted microscope, the cell growth curve was plotted and the drug sensitivity test was conducted with DDP by MTT method. Results:The new 3D culture system of MCF-7 cell line was successfully established by the improved anchor method. The typical grape-like multicellular spheroids (～160μm) were observed in the new 3D system rather than in the 2D culture system. The cell growth rate in the new 3D culture system was significantly faster than that in the conventional 3D culture system prepared by mixing method (P＜0.05). The cell proliferation inhibition ratio by DDP in the new 3D system was significantly lowered compared with that in the 2D culture system (P＜0.01). Conclusion:The new 3D cell culture system of human breast cancer prepared by the improved anchor method is close to in vivo tumor growth environment, in which the tumor cells could mimic the drug-resistant characteristics of in vivo solid tumor. Therefore the new 3D cell culture system is more practicable for the activity screening of anticancer candidates than the conventional ones.

human breast cancer cell; three dimensional culture; anchor method; drug sensitivity

R73-351

A

1001-5094（2014）01-0046-05

接受日期：2013-04-13

項目資助:江蘇省自然科學青年基金項目(No.BK20130395)；*

張偉,教授；

研究方向:心血管、腫瘤及神經(jīng)藥理學；

Tel:0513-85051728；E-mail:zhang_wei605@163.com

奚濤,教授；

研究方向:腫瘤藥理學；

Tel:025-83271022；E-mail:xi_tao18@163.com

An Improved Three-dimensional Cell Culture Model of Human Breast Cancer as Well as Drug Sensitivity Investigation