苑 方，王海云，于泳浩，王國林

瑞芬太尼痛覺過敏大鼠Delta阿片受體mRNA的表達(dá)水平

苑 方，王海云，于泳浩，王國林

目的：探討切口痛-瑞芬太尼痛覺過敏大鼠背根神經(jīng)節(jié)及海馬Delta阿片受體mRNA表達(dá)水平的變化。方法：健康雄性SD大鼠32只，尾靜脈置管后隨機(jī)分為4組，瑞芬太尼組（R組）輸注瑞芬太尼1μg·kg-1·min-1，切口痛組（I組）輸注等體積生理鹽水，甘氨酸組（G組）輸注甘氨酸15μg·kg-1·min-1，對照組（C組）輸注等體積生理鹽水，最后一次痛閾測定后留取大鼠L4～L6背根神經(jīng)節(jié)及海馬標(biāo)本，應(yīng)用實時定量PCR方法測定Delta阿片受體mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：R組、I組、G組均發(fā)生痛覺過敏，且R組痛覺過敏的程度高于I組和G組；R組海馬Delta阿片受體mRNA表達(dá)水平（4.359±1.031）顯著高于C組、I組（2.373±1.014）和G組（2.411±0.326）（P＜0.05）；R組背根神經(jīng)節(jié)Delta阿片受體mRNA表達(dá)水平（2.108±0.361）顯著高于C組、I組（1.409±0.435）和G組（1.413±0.234）（P＜0.05）。結(jié)論：瑞芬太尼可在切口痛模型大鼠中引發(fā)痛覺過敏，其機(jī)制可能與背根神經(jīng)節(jié)及海馬Delta阿片受體mRNA表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

痛覺過敏；瑞芬太尼；Delta阿片受體；實時定量PCR；大鼠

阿片類藥物引發(fā)的痛覺過敏現(xiàn)象(opioids induced hyperalgesia,OIH)不僅降低了藥物的鎮(zhèn)痛效果，還可促進(jìn)痛覺感知，產(chǎn)生異常疼痛，甚至引發(fā)術(shù)后慢性疼痛的發(fā)生[1-2]。瑞芬太尼為純粹的μ阿片受體激動劑，起效迅速，鎮(zhèn)痛作用消退快，產(chǎn)生的痛覺過敏的發(fā)生率明顯高于其他阿片類藥物[3-4]。采用藥物拮抗或基因敲除方法抑制Delta阿片受體，可增強μ阿片受體激動劑的抗傷害性感受作用，同時抑制OIH的發(fā)生[5]。本研究通過評價切口痛-瑞芬太尼痛覺過敏大鼠海馬及背根神經(jīng)節(jié)Delta阿片受體mRNA表達(dá)的變化，探討Delta阿片受體在瑞芬太尼引發(fā)痛覺過敏中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量250～280 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 Brennan切口痛模型制備 腹腔內(nèi)注入10%水合氯醛0.3 mL/kg，手術(shù)區(qū)域備皮消毒，于右后足底用11號刀片行1 cm長縱行切口，從足跟近端0.5 cm延伸至足趾方向，切開足底皮膚和筋膜，顯露跖肌?？v行切開跖肌，保持其起止端的完整。輕壓止血，5-0絲線縫合切口，傷口處涂抹紅霉素軟膏。

1.3 分組及給藥方式 隨機(jī)分為4組（n=8）。R組（瑞芬太尼）麻醉后尾靜脈置管，建立切口痛模型，持續(xù)輸注瑞芬太尼1μg·kg-1·min-1（宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號6131214）。C組（對照組）輸注等體積生理鹽水。I組（切口痛組）輸注等體積生理鹽水。G組（甘氨酸組）輸注甘氨酸（商品化瑞芬太尼賦形劑，中國藥品生物制品檢定所，批號735-200102）15μg·kg-1·min-1。各組輸注時間均為60min。

1.4 機(jī)械刺激PWT和熱刺激PWL測定 分別于術(shù)前24 h（T0）、術(shù)后24 h（T1）、48 h（T2）在室溫[（20± 2）℃]安靜環(huán)境中測定機(jī)械刺激PWT和熱刺激PWL。將大鼠放置于20 cm×20 cm×20 cm金屬籠，適應(yīng)2 h，用電子von Frey絲（Harvard Apparatus公司，美國）透過金屬籠底垂直刺激左后肢足底中部，逐漸加壓，出現(xiàn)快速縮足反應(yīng)、舔舐右足或嘶叫動作為陽性反應(yīng)。停止加壓，記錄其壓力值（g），即為大鼠PWT。每只大鼠測定3次，間隔15 s，取其平均值。壓力值大于25 g時，記為25 g。應(yīng)用YLS-6B智能熱板儀（安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）測定大鼠PWL，記錄從大鼠左后足接觸熱板致出現(xiàn)回縮、踮腳、掙扎、嘶叫、舐足任一反應(yīng)的時間作為PWL。每只大鼠測定3次，間隔10min,取其平均值。為防止大鼠燙傷，將PWL上限值定為30 s。

1.5 背根神經(jīng)節(jié)及海馬Delta阿片受體mRNA表達(dá)檢測 術(shù)后48 h測定各組大鼠的機(jī)械性PWT及熱板PWL，用手術(shù)剪斷頭處死大鼠，眼科剪從椎管縱向剪開顱骨，沿中線分開兩個大腦半球，分離皮層組織，取出海馬。取背中線切口逐層解剖暴露脊椎，小心剪開椎板，取出L4～L6 DRG。將組織迅速置于液氮中冷凍，-80℃冰箱保存。將標(biāo)本放入加有2～3倍體積Trizol（Invitrogen公司，美國）的勻漿器中，在冰浴中充分勻漿。按步驟提取總RNA。對總RNA的濃度、純度及完整性進(jìn)行檢測，使用高效cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（ABI公司，美國）將2μg總RNA定量逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用Taqman?基因表達(dá)探針（ABI公司，美國）通過實時定量PCR檢測Delta阿片受體mRNA的表達(dá)。選擇GAPDH作為內(nèi)源性對照。在96孔板上設(shè)置PCR反應(yīng)，20μL反應(yīng)體系中包括Taqman?基因表達(dá)預(yù)混液、Taqman?基因表達(dá)探針、cDNA模板及去RNA酶水。PCR程序設(shè)置為UP酶激活95℃10 min；變性95℃15 s；延伸60°C 1 min。程序2和3為40個循環(huán)。通過比較閾值法計算目的基因的相對表達(dá)量，即用2-△Ct將原始數(shù)據(jù)（△Ct值）轉(zhuǎn)化成線性形式，再以2-△△CT方法計算mRNA的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD法，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

32只SD大鼠尾靜脈穿刺置管100%成功，術(shù)后均無感染、無死亡，全部順利完成實驗要求。與術(shù)前24 h相比較，術(shù)后（24 h、48 h）I組、G組及R組機(jī)械縮爪閾值及熱板縮爪潛伏期降低（P＜0.05）。與C組相比較，I組、G組及R組機(jī)械縮爪閾值及熱板縮爪潛伏期降低（P＜0.05）。與I組和G組相比較，R組機(jī)械縮爪閾值及熱板縮爪潛伏期降低（P＜0.05）。見圖1、圖2。

圖1 各組大鼠不同時間點機(jī)械性PWT的比較

圖2 各組大鼠不同時間點熱板PWL的比較

與C組相比較，I組、G組及R組海馬及背根神經(jīng)節(jié)Delta阿片受體mRNA表達(dá)上調(diào)。與I組及G組相比較，R組海馬及背根神經(jīng)節(jié)Delta阿片受體mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。見表1、表2。

表1 各組大鼠海馬DOR mRNA表達(dá)水平比較(±s)

表1 各組大鼠海馬DOR mRNA表達(dá)水平比較(±s)

注：與C組相比，aP＜0.05；與I組和G組相比，bP＜0.05

2-△Ct 2-△△CT C組I組G組R組△Ct 11.591±0.365 10.469±0.404 10.485±0.281 9.503±0.157 0.000 33±0.000 08 0.000 73±0.000 20 0.000 71±0.000 14 0.001 39±0.000 16△△Ct 0 -1.122±0.481 -1.260±0.189 -2.088±0.362 1 2.373±1.014a2.411±0.326a4.359±1.031a、b

表2 各組大鼠DRG中DOR mRNA表達(dá)水平比較(±s)

表2 各組大鼠DRG中DOR mRNA表達(dá)水平比較(±s)

注：與C組相比，aP＜0.05；與I組和G組相比，bP＜0.05

2-△Ct 2-△△CT C組I組G組R組△Ct 11.846±0.100 11.408±0.379 11.362±0.233 10.921±0.231 0.000 27±0.000 02 0.000 38±0.000 10 0.000 38±0.000 07 0.000 52±0.000 08△△Ct 0 -0.438±0.188 -0.484±0.127 -1.065±0.267 1 1.409±0.435a1.413±0.234a2.108±0.361a、b

3 討論

大鼠足底切口痛模型是痛覺過敏研究中廣泛應(yīng)用的經(jīng)典模型。參照Brennan法建立的大鼠切口疼痛模型的疼痛行為以及其持續(xù)時間，與臨床上外科手術(shù)和術(shù)后狀態(tài)一致，為研究術(shù)后疼痛機(jī)制較理想的動物模型。高劑量瑞芬太尼可誘發(fā)術(shù)后痛覺過敏。Joly等[6]在一項臨床調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)瑞芬太尼以0.05～0.3μg·kg-1·min-1的速度輸注60～90min，就會造成患者術(shù)后嗎啡鎮(zhèn)痛劑量的增加，引發(fā)痛覺過敏現(xiàn)象。大鼠與人的等效劑量比值為6.3，即相同給藥途徑，大鼠的給藥劑量＝6.3×人的給藥劑量。有研究[7]表明，接受致敏劑量瑞芬太尼的切口痛模型，大鼠痛覺過敏現(xiàn)象始于術(shù)后24 h，術(shù)后24～48 h達(dá)到高峰。本實驗將研究時間點確定為術(shù)前24 h（基礎(chǔ)值）及術(shù)后24 h、48 h，根據(jù)結(jié)果，與C組相比較，術(shù)后（24 h、48 h）I組、G組及R組機(jī)械縮爪閾值和熱板縮爪潛伏期顯著降低。表明大鼠出現(xiàn)痛覺過敏現(xiàn)象，足底切口痛模型建立成功。

Delta阿片受體是3種主要的阿片受體之一，它分散的分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,其分布呈一定的梯度性，前腦水平較高，而后腦部相對較低。在脊髓背角部位也有其分布，可介導(dǎo)Delta阿片受體激動劑的鎮(zhèn)痛作用[8]。本研究結(jié)果顯示，與C組、I組和G組相比較，R組大鼠術(shù)后（24 h、48 h）機(jī)械縮爪閾值和熱板縮爪潛伏期顯著降低，出現(xiàn)明顯的痛覺過敏現(xiàn)象，且海馬及背根神經(jīng)節(jié)Delta阿片受體mRNA表達(dá)上調(diào)，表明瑞芬太尼所誘發(fā)的痛覺過敏與海馬及背根神經(jīng)節(jié)Delta阿片受體mRNA表達(dá)上調(diào)有關(guān)。其可能機(jī)制為，瑞芬太尼通過上調(diào)Delta阿片受體mRNA的表達(dá)激活Delta阿片受體，強化NMDA受體中內(nèi)向電流，快速而持久的增加NMDA受體的反應(yīng)性[9]。NMDA受體的激活可以放大神經(jīng)細(xì)胞中的鈣信號，使傷害性感受信號傳入增加，導(dǎo)致痛覺過敏現(xiàn)象的發(fā)生。

瑞芬太尼可在切口痛模型大鼠中引發(fā)痛覺過敏，其機(jī)制可能與海馬及背根神經(jīng)節(jié)Delta阿片受體mRNA表達(dá)上調(diào)有關(guān)，從而為臨床治療瑞芬太尼所引發(fā)的痛覺過敏提供了新的方向。

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（收稿：2014-03-26 修回：2014-06-26）

（責(zé)任編輯 余劍波）

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研究涉及基金項目的標(biāo)識

論文所涉及的基金項目，應(yīng)在文章首頁左下角以“基金項目”作為標(biāo)識注明基金項目名稱，并在圓括號內(nèi)注明其項目編號?；痦椖棵Q應(yīng)按國家有關(guān)部門規(guī)定的正式名稱填寫，多項基金應(yīng)依次列出，其間以分號（；）隔開。如“基金項目：國家自然科學(xué)基金（30271269）；‘十五’國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（2003AA205005）”，作為腳注的第1項。

Expression of Delta-opioid Receptor in Rats with Remifentanil-induced Hyperalgesia

YUAN Fang, WANG Hai-yun,YU Yong-hao,et al.
Department of Anesthesiology,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin(300052),China

Objective To investigate the changes in the expression of delta-opioid receptor in dorsal root ganglion and hippocampus in rats with incisional pain(IP)-remifentanil-induced hyperalgesia.MethodsThirty-two SD male rats(250～280 g)were random ly divided into 4 groups：group R,remifentanil 1μg·kg-1·min-1was infused intravenously;group I,the same volume of saline was infused intravenously;group G,glycine 15μg· kg-1·min-1was infused intravenously;group C,the same volume of saline was infused intravenously.Each animal was sacrificed after the last behavioral measurement.The dorsal root ganglion and hippocampus were removed for the evaluation of the expression of delta-opioid receptor mRNA by quantitative RT-PCR.ResultsRemifentanil-induced hyperalgesia developed in group R,I and G.Comparing with group C,I(2.373±1.014)and G (2.411±0.326),the expression of delta-opioid receptor mRNA in hippocampus was significantly up-regulated in group R(4.359±1.031)(P＜0.05).Comparing with group C,I(1.409±0.435)and G(1.413±0.234),the expression of delta-opioid receptor mRNA in dorsal root ganglion was significantly up-regulated in group R(2.108± 0.361)(P＜0.05).ConclusionThese data indicate that the increased expression of delta-opioid receptor mRNA in dorsal root ganglion and hippocampus is involved in remifentanil-induced-hyperalgesia.

Hyperalgesia；remifentanil；delta-opioid receptor；qRT-PCR；rats

Q95-33;R971+.1

A

1007-6948(2014)05-0507-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2014.05.013

國家自然科學(xué)基金（30972847）

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院麻醉科（天津 300052）

于泳浩，E-mail：yuyonghao@126.com