張?chǎng)╈o，陳潔，孔靜萍

兩種型號(hào)的自動(dòng)免疫組化染色機(jī)的應(yīng)用及體會(huì)

張?chǎng)╈o，陳潔，孔靜萍

目的探討兩種型號(hào)的自動(dòng)免疫組化染色機(jī)在病理工作中的應(yīng)用。方法收集已診斷明確的乳腺癌標(biāo)本30例和卵巢癌標(biāo)本10例，選擇5種常用的免疫標(biāo)記，分別用ROCHE公司的BenchMark XT和DAKO公司的Autostainer Link 48自動(dòng)免疫組化染色機(jī)分別進(jìn)行染色。結(jié)果兩種型號(hào)的自動(dòng)免疫組化染色機(jī)均取得較為滿意的染色結(jié)果，信號(hào)強(qiáng)，結(jié)構(gòu)清晰，定位準(zhǔn)確，非特異性染色著色少。結(jié)論自動(dòng)免疫組化染色機(jī)標(biāo)準(zhǔn)化程度高，能為臨床病理診斷提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。

試劑；抗原修復(fù)；一抗；自動(dòng)免疫組化染色機(jī)

臨床對(duì)病理工作的要求越來(lái)越高，病理診斷和方法的標(biāo)準(zhǔn)化尤其顯得重要，其中技術(shù)規(guī)范化是標(biāo)準(zhǔn)化的一個(gè)重要方面。自動(dòng)免疫組化染色機(jī)對(duì)免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化程度的提高起到了一定的推動(dòng)作用[1]。寧波市病理中心從2011年底引進(jìn)8臺(tái)ROCHE公司的BenchMarkXT和DAKO公司的AutostainerLink48自動(dòng)免疫組化染色機(jī)，染色結(jié)果較為滿意。本文就這兩種型號(hào)的自動(dòng)免疫組化染色機(jī)的操作及不同點(diǎn)作一探討?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料收集病理中心2012年6月至2013年1月期間已診斷明確的乳腺癌標(biāo)本30例和卵巢癌標(biāo)本10例，選擇雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（Her-2）、細(xì)胞角蛋白廣譜（CK-pan）和卵巢癌抗原（CA125）這幾種較為常用的免疫標(biāo)記，ROCHE公司的BenchMark XT自動(dòng)免疫組化染色機(jī)，DAKO公司的AutostainerLink48自動(dòng)免疫組化染色機(jī)，PTLINK脫蠟修復(fù)一體機(jī)，二抗及DAB顯色系統(tǒng)、復(fù)染液均為機(jī)器自帶的成品配套試劑。

1.2 方法標(biāo)本用10%甲醛進(jìn)行固定，經(jīng)自動(dòng)脫水機(jī)進(jìn)行脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋后行組織切片，切片厚度3m，無(wú)皺褶和刀痕，同一組織連續(xù)切兩張切片，各兩組，石蠟切片在（60±5）℃恒溫箱烤片，時(shí)間在40min左右，最長(zhǎng)不超過(guò)2h，以免破壞組織中的抗原，分別用兩張型

號(hào)的免疫組化染色機(jī)進(jìn)行染色操作。

1.2.1 BenchMark XT染色機(jī)根據(jù)一抗及蠟塊信息，打印條形碼標(biāo)簽，端正貼于切片上，打開儀器將切片按標(biāo)簽朝金屬盤中心放置在切片盤上，確保每張切片放穩(wěn)，固定于4個(gè)卡齒之內(nèi)；將二抗DAB試劑盒、復(fù)染液、一抗等試劑瓶放在檢測(cè)試劑架上，檢查加樣口是否充滿液體，確認(rèn)儀器裝載的AFM試劑桶中有足夠多的滿足本次運(yùn)行的試劑量，打開計(jì)算機(jī)桌面上的Ventana NexES軟件，確認(rèn)信息后，啟動(dòng)電腦程序。染色完成后，取出切片并用洗潔精洗去玻片上的油污，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.2 Autostainer Link 48染色機(jī)輸入信息并打印二維碼標(biāo)簽貼于切片上，將切片插入切片架的切片夾上浸泡于PT LINK脫蠟修復(fù)一體機(jī)進(jìn)行脫蠟水化抗原修復(fù)，完成后移出切片架立即浸入含有0.05%Tween20的緩沖液中至少5 min，將本次運(yùn)行所需的試劑瓶按瓶口在左，二維碼在右放于試劑架上，確認(rèn)有滿足此次運(yùn)行的試劑量，將切片架置于染色儀中，打開軟件進(jìn)入儀器界面，點(diǎn)擊“START”開始染色程序，運(yùn)行結(jié)束后，同樣進(jìn)行脫水、透明、封片步驟。

2 結(jié)果

兩種型號(hào)的自動(dòng)免疫組化染色機(jī)染色均勻，結(jié)構(gòu)清晰，定位準(zhǔn)確，無(wú)邊緣效應(yīng)，非特異性著色少。ER、PR、Her-2、CK-pan免疫標(biāo)記染色強(qiáng)度差異不明顯（封三彩圖9～10），但CA125標(biāo)記，Bench-MarkXT染色強(qiáng)度高于AutostainerLink 48（封四彩圖1）。

3 討論

自動(dòng)免疫組化染色機(jī)染色結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)性高，為免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化提供了有力的條件[2]。兩種型號(hào)儀器的實(shí)驗(yàn)條件及操作方式也有所不同，現(xiàn)分析如下。

3.1 染色程序運(yùn)行前BenchMark XT注冊(cè)新試劑是用注冊(cè)棒接觸注冊(cè)卡上的數(shù)據(jù)按鈕，關(guān)聯(lián)抗體信息及成品配套試劑盒中的試劑信息，使用的標(biāo)簽采用條形碼技術(shù)，條形碼標(biāo)簽需端正貼于玻片上，不能有皺折，標(biāo)簽表面無(wú)水分，才能保證儀器正常掃描[3]。用戶填充試劑瓶加注一抗時(shí)，為保證抗體效價(jià)應(yīng)每次少量灌注，只需能滿足此次運(yùn)行所需的抗體量，試劑瓶管口呈半月形液面，不需要一定的底液（廢液）量；每個(gè)染色方案默認(rèn)的試劑加液量均為100l，一臺(tái)Bench-Mark XT染色機(jī)一次可運(yùn)行的容量為30張切片，開放性試劑架上可以選擇應(yīng)用35種不同的試劑（包括配套試劑盒、一抗等）。Autostainer Link 48定義一個(gè)新試劑是用紅外線掃描儀掃描試劑瓶口旁的二維碼信息，軟件自動(dòng)儲(chǔ)存試劑信息。它所使用的是二維碼標(biāo)簽，二維碼信息密度高，糾錯(cuò)能力強(qiáng)，相對(duì)尺寸小，比作為一維碼的條形碼更具有優(yōu)勢(shì)，在程序運(yùn)行中掃描更快捷[4]。每個(gè)試劑瓶按瓶子本身的規(guī)格，5 ml試劑瓶和12 ml試劑瓶各有0.6 ml和1.2 ml的底液量，這些試劑量也就是廢液量，不能用于本次染色程序，是額外增加的試劑成本。在染色程序運(yùn)行前，實(shí)驗(yàn)人員可根據(jù)每張切片上的組織塊位置，調(diào)整試劑滴加的位置和試劑量，一般一個(gè)加樣區(qū)滴加150 l，如果組織比較大需要二個(gè)加樣區(qū)，每個(gè)區(qū)域的加樣量各為100l。一臺(tái)Autostainer Link 48染色機(jī)一次可運(yùn)行48張切片，一個(gè)工作臺(tái)可裝載兩個(gè)獨(dú)立的試劑架，每個(gè)試劑架容納21個(gè)試劑瓶，一次運(yùn)行的數(shù)量比BenchMark XT染色機(jī)多。

3.2 運(yùn)行染色程序BenchMarkXT染色機(jī)脫蠟、抗原修復(fù)、孵育、顯色、復(fù)染全都在機(jī)器內(nèi)自動(dòng)完成，染色過(guò)程中裝有切片的金屬盤處于密閉狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)人員通過(guò)軟件監(jiān)控切片盤的溫度、壓力，試劑加樣等情況。一臺(tái)儀器從掃描到進(jìn)入染色程序需要5 min，如試劑裝載錯(cuò)誤或切片放置不平，在校正后染色機(jī)重新掃描程序。切片用PH8.4的EDTA修復(fù)，抗原修復(fù)溫度為99.5℃，一抗孵育溫度是37℃，采用Thermopad溫控技術(shù)，每張切片獨(dú)立溫控，37℃至95℃4min，95℃至37℃7min，提供最佳反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。利用空氣渦流混勻技術(shù)，保證組織全層覆蓋，試劑充分混勻，避免邊緣效應(yīng)和階梯效應(yīng)。在染色過(guò)程中，每次加樣后都會(huì)滴加液體封蓋膜，保證試劑不被蒸發(fā)，提供穩(wěn)定的染色結(jié)果。每次加樣前后都有清洗步驟，利用雙清洗和噴氣清洗，保證洗去之前染色的殘留液，減少背景著色。Autostainer Link 48染色機(jī)的脫蠟及修復(fù)程序是在PT LINK機(jī)上完成，其他步驟則是在染色機(jī)上完成。PTLINK儀器將稀釋比1∶50的PH 9.0 EDAT修復(fù)液預(yù)熱至65℃，費(fèi)時(shí)14min，然后放入切片架后進(jìn)行脫蠟修復(fù)，95℃熱浴10～15min，修復(fù)結(jié)束并冷卻至70℃后，移出切片架至緩沖液中至少浸泡5 min后上機(jī)。染色機(jī)是半敞開式的，便于實(shí)驗(yàn)人員更直觀的觀察切片的染色情況。從掃描開始到進(jìn)行染色程序需時(shí)2 min，試劑瓶放置不正確或缺如，重新裝載后，掃描會(huì)從上次掃描的最后位接下去繼續(xù)讀取試劑信息，節(jié)省了運(yùn)行時(shí)間。染色過(guò)程在室溫中進(jìn)行，每次加樣前，機(jī)械臂中的空氣噴嘴泵去除上次試驗(yàn)的試劑并用PBS緩沖液沖洗切片，之后試劑探針滴加試劑。保濕室關(guān)閉時(shí)，創(chuàng)建一個(gè)密封的環(huán)境，確保切片在運(yùn)行中不干燥，防止出現(xiàn)非特異性背景著色。Autostainer Link 48染色機(jī)滴加一抗試劑時(shí)，只是滴加在實(shí)驗(yàn)人員定義的組織在玻片上的位置，如遇到組織體積大，由于沒有混勻技術(shù)，試劑不能全層覆蓋，會(huì)出現(xiàn)染色不均的情況（封四彩圖2）。

3.3 儀器的清洗、維護(hù)BenchMark XT染色機(jī)每次運(yùn)行結(jié)束后均應(yīng)執(zhí)行清洗循環(huán)，每周用熱肥皂水、熱水、去離子水依次清潔切片盤，定期清洗廢液桶，向空桶中加入一定量的的濃縮消毒滅菌液，保持?jǐn)?shù)分鐘后排空。用“花王”牌漂白水進(jìn)行季度保養(yǎng)維護(hù)，每染色制片12 500張或每6個(gè)月需由專業(yè)工程師進(jìn)行全面維護(hù)，以保證儀器發(fā)揮其最佳性能[4]。Autostainer Link 48染色機(jī)軟件從最后一個(gè)清洗循環(huán)監(jiān)控染色切片的數(shù)量，每完成200張切片，機(jī)器自動(dòng)提示需進(jìn)行一次清洗循環(huán)。為保證染色正常運(yùn)行，所有的試劑瓶必須保持清潔，應(yīng)使用無(wú)水乙醇沖洗3遍以清除潛在的污染物，每次使用后，用去離子水沖洗切片架，刷去積存的殘留鹽，每年的維修由專業(yè)的DAKO技師完成，基礎(chǔ)的預(yù)防性維護(hù)必須聯(lián)系當(dāng)?shù)氐腄AKO代表進(jìn)行操作。

總之，使用自動(dòng)免疫組化染色機(jī)縮

短了操作時(shí)間，使預(yù)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化，提供了靈活的程序，保證染色結(jié)果的穩(wěn)定，可以有效地保證染色的準(zhǔn)確性，可重復(fù)性及整體染色的一致性[5]，自動(dòng)免疫組化染色機(jī)標(biāo)準(zhǔn)化程度高，能為臨床病理診斷提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。

[1]陳芳,李海.全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)的應(yīng)用[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011, 10（20）:1613-1614.

[2]楊月紅,袁靜萍,袁修學(xué),等.自動(dòng)免疫組化儀的使用體會(huì)[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2011,27(3):333-334.

[3]林蓁,田甜.提高全自動(dòng)免疫組化儀制片質(zhì)量的相關(guān)細(xì)節(jié)[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2012,28（6）:700-701.

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[5]羅玉鳳,曹金伶,楊春明,等.免疫組化手工操作與機(jī)器制片染色比較[J].協(xié)和醫(yī)學(xué)雜志,2012,3(1):117-119.

10.3969/j.issn.1671-0800.2014.12.065

R446

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