修江帆 魏川川 陳明明 吳建偉

（貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550004）

不同誘導(dǎo)條件下家蠅（Musca domestica）三齡幼蟲(chóng)免疫相關(guān)基因的表達(dá)研究

修江帆 魏川川 陳明明 吳建偉

（貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550004）

旨在研究在不同誘導(dǎo)條件下家蠅三齡幼蟲(chóng)先天性免疫基因的表達(dá)情況。采用冷刺激、熱刺激及革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌注射誘導(dǎo)12 h后提取家蠅三齡幼蟲(chóng)總RNA。根據(jù)GenBank公布的家蠅磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）基因、攻擊素（Attacin）、天蠶素（Cecropin）、防御素（Defensin）、雙翅肽（Diptericin）、溶菌酶（Lysozyme）、熱休克蛋白（Heat shock protein，HSP）及家蠅抗真菌肽（MAF-1）基因序列進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參照，分析在不同誘導(dǎo)條件下家蠅三齡幼蟲(chóng)先天性免疫基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，不同條件誘導(dǎo)下，家蠅免疫相關(guān)基因表達(dá)顯現(xiàn)較大差異，微生物誘導(dǎo)比物理刺激誘導(dǎo)后家蠅免疫相關(guān)基因表達(dá)水平高；真菌、陽(yáng)性菌誘導(dǎo)后家蠅免疫相關(guān)基因表達(dá)量最高，陰性菌次之；冷刺激誘導(dǎo)最低。微生物及物理刺激均能激活家蠅的免疫系統(tǒng)，在不同條件刺激下，家蠅幼蟲(chóng)機(jī)體免疫應(yīng)激反應(yīng)不同。

家蠅 誘導(dǎo) 先天性免疫 基因表達(dá)

家蠅是一種世界性廣泛分布的昆蟲(chóng)，隸屬于昆蟲(chóng)綱雙翅目環(huán)裂亞目蠅科蠅屬。家蠅從幼蟲(chóng)到成蟲(chóng)均喜好生活在病原物富集的環(huán)境中，其體表可攜帶多種病原體，而自身卻不受到病原物的侵害。這一特性歸功于其獨(dú)特而完善的免疫防御機(jī)制。家蠅不具有T、B淋巴系統(tǒng)，因此不具有高等動(dòng)物的獲得性免疫系統(tǒng)，然而，昆蟲(chóng)之所以能夠?qū)Σ≡w的侵入做出迅速、有效的免疫應(yīng)答，表明昆蟲(chóng)具有對(duì)非特異因子產(chǎn)生免疫應(yīng)答的高效先天性免疫系統(tǒng)。昆蟲(chóng)的先天性免疫可分為體液免疫和細(xì)胞免疫。細(xì)胞

免疫主要依靠血細(xì)胞對(duì)病原體進(jìn)行包裹、吞噬等作用完成的。體液免疫主要通過(guò)脂肪體細(xì)胞產(chǎn)生抗菌肽來(lái)抵抗、清除外源病原體［1，2］。

抗菌肽是一類普遍存在的防御性蛋白質(zhì)，具有分子量小、理化性能穩(wěn)定和廣譜抗菌等特點(diǎn)，在昆蟲(chóng)先天免疫防御系統(tǒng)中起著重要的作用［3］?？咕幕虻谋磉_(dá)是受到嚴(yán)格基因調(diào)控的，不同病原體可通過(guò)激活不同的信號(hào)通路產(chǎn)生各類抗菌肽分子。以模式生物果蠅為例，真菌與大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌激活Toll受體介導(dǎo)的信號(hào)途徑，調(diào)控果蠅抗真菌肽（Drosomycin）基因表達(dá)；革蘭氏陰性菌激活I(lǐng)MD信號(hào)途徑，調(diào)控果蠅抗菌肽（Drosocin）、雙翅肽（Diptericin）等基因表達(dá)；而防御素（Defensin）和攻擊素（Attacin）等基因受到Toll及IMD信號(hào)途徑共同調(diào)控［4］。

昆蟲(chóng)體液免疫除了抗菌肽發(fā)揮主要作用外，體內(nèi)一些復(fù)合功能性酶及分子伴侶在先天性免疫系統(tǒng)中同樣發(fā)揮不可替代的作用。溶菌酶（Lysozyme）能催化細(xì)菌細(xì)胞壁中黏多糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的1，4-糖苷鍵的水解，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁破裂、內(nèi)容物溢出使細(xì)菌死亡［5］。熱休克蛋白可協(xié)助蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)輸，放置蛋白質(zhì)前體積累并刺激蛋白轉(zhuǎn)移，在應(yīng)激情況下能起到穩(wěn)定多肽鏈，防止其失活，保護(hù)機(jī)體的作用［6］。

家蠅作為一種與人類生活密切相關(guān)的病原生物，關(guān)于其先天性免疫系統(tǒng)激活及先天性免疫相關(guān)基因之間協(xié)同作用的相關(guān)研究報(bào)道相對(duì)較少。本研究擬選用不同誘導(dǎo)方式及多種微生物分別誘導(dǎo)激活家蠅免疫系統(tǒng)，研究其免疫相關(guān)基因的相互作用，旨在為今后系統(tǒng)研究家蠅先天性免疫信號(hào)通路奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 家蠅3齡幼蟲(chóng)為本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，幼蟲(chóng)均重26.5 mg，飼養(yǎng)溫度28℃，相對(duì)濕度65%，光照周期10 L∶14 D。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 供試菌株，大腸桿菌（Escherich coliDH5α），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC6538），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisCMCC 63501），白色念珠菌（Monilia albicanATCC10231），新生隱球菌（Cryptococcus neoformansF517）為中國(guó)生物藥品檢定所提供，本實(shí)驗(yàn)室保存；綠色膿桿菌（Bacteriump ocyaneum）臨床鑒定分離株由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌標(biāo)本室提供，試驗(yàn)在二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.3 主要試劑 總RNA提取試劑盒（RNAiso PLUS）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、DNA標(biāo)志物（DL2000 DNA Marker）、瓊脂糖等購(gòu)置于TaKaRa公司，其余試劑購(gòu)置于上海生工公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)靶基因選擇及引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的7種家蠅先天性免疫相關(guān)基因和內(nèi)參照磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）基因序列，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（引物序列見(jiàn)表1）。引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。使用前用滅菌DEPC處理水稀釋至20 μmol/L。

1.2.2 家蠅幼蟲(chóng)的誘導(dǎo)

1.2.2.1 物理誘導(dǎo) 熱刺激家蠅幼蟲(chóng)（RJ組），依照本課題組常楚瑞［7］方法，將家蠅幼蟲(chóng)置于干凈平皿中，65℃放置1 min，取出后室溫靜置5 min；重復(fù)該過(guò)程2次；之后將其再置入65℃放置5 min，取出后將幼蟲(chóng)放入潔凈培養(yǎng)皿中繼續(xù)飼養(yǎng)6 h后提取總RNA。冷刺激家蠅幼蟲(chóng)（BD組），將家蠅幼蟲(chóng)置于潔凈平皿中-20℃放置1 min，取出后室溫靜置5 min；重復(fù)該過(guò)程2次；之后將其再置入-20℃放置5 min，取出后將幼蟲(chóng)放入潔凈培養(yǎng)皿中繼續(xù)飼養(yǎng)6 h后提取總RNA。機(jī)械損傷誘導(dǎo)（PBS組），注射PBS溶液5 μL作為機(jī)械損傷對(duì)照，將誘導(dǎo)后幼蟲(chóng)放入潔凈培養(yǎng)皿中繼續(xù)飼養(yǎng)6 h后提取總RNA。設(shè)置正常條件飼養(yǎng)作為空白對(duì)照（空白組），每組試驗(yàn)進(jìn)行生物重復(fù)3次。

1.2.2.2 微生物菌液注射誘導(dǎo) 分別液體培養(yǎng)微生物，至菌體密度達(dá)到2×107-9×107，菌液經(jīng)5 000×g離心3 min后，棄上清液，PBS緩沖液重懸菌液，用微量注射器進(jìn)行幼蟲(chóng)腹腔注射，注射量為5 μL。取出后將幼蟲(chóng)放入潔凈培養(yǎng)皿中繼續(xù)飼養(yǎng)6 h后提取總RNA。試驗(yàn)分為革蘭氏陰性菌：大腸桿菌誘導(dǎo)組（DC組），綠色膿桿菌誘導(dǎo)組（LN組）；革蘭氏陽(yáng)性菌：金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)組（JP組），枯

草芽孢桿菌誘導(dǎo)組（KC組）；真菌：白色念珠菌誘導(dǎo)組（BN組）；新生隱球菌誘導(dǎo)組（XY組），每組試驗(yàn)進(jìn)行生物重復(fù)3次。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

1.2.3 家蠅總RNA提取及cDNA的合成 分別提取各試驗(yàn)組單只幼蟲(chóng)RNA，總RNA得抽提按照TaKaRa公司的RNAiso PLUS說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作?？俁NA經(jīng)電泳檢測(cè)，GeneQuant公司核酸定量分析儀測(cè)定A260/A280比值及濃度，選取A260/A280的比值范圍為1.95-2.00的樣本，以1 μg總RNA為模板，按照cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈。

1.2.4 RT-PCR及產(chǎn)物鑒定 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：LA PCR buffer 2.5 μL，Taq酶（5 U/μL）0.5 μL，dNTPs Mixture（10 nmol/L）0.4 μL，上下游引物（20 nmol/L）各1.0 μL，模板cDNA（100 ng/μL）1.0 μL，雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 1 min，60℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，擴(kuò)增完畢后10℃終止反應(yīng)。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物做2.0%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色，凝膠呈現(xiàn)系統(tǒng)觀察并記錄（3500R型，Tanon）。

1.2.5 家蠅先天性免疫相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的分析 凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳圖譜進(jìn)行掃描記錄，運(yùn)用Quantity One（V4.6.2）分析電泳圖，記錄擴(kuò)增基因片段的光密度值。計(jì)算家蠅先天性免疫相關(guān)基因與內(nèi)參基因的光密度比值（Band Relative Value），衡量家蠅定量分析不同狀態(tài)下先天性免疫相關(guān)基因的表達(dá)量［8］。運(yùn)用PASW Statistics 18軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將數(shù)據(jù)結(jié)果輸入GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行圖像繪制。

2 結(jié)果

2.1 家蠅內(nèi)參基因及先天性先天性免疫基因RTPCR擴(kuò)增結(jié)果

半定量RT-PCR檢測(cè)家蠅三齡幼蟲(chóng)不同狀態(tài)下各基因表達(dá)情況。PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖1）顯示，均能擴(kuò)增出特異性單一條帶，與對(duì)應(yīng)的基因片段理論值大小相符。不同狀態(tài)下內(nèi)參基因GAPDH條帶亮度穩(wěn)定，其余各基因具有差異表達(dá)。

2.2 不同誘導(dǎo)條件下各相關(guān)基因mRNA表達(dá)量比較

數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，得到不同狀態(tài)下家蠅幼蟲(chóng)先天性免疫相關(guān)基因表達(dá)情況結(jié)果（表2）。

2.2.1 Attacin基因表達(dá) Attacin基因經(jīng)誘導(dǎo)后均明顯上調(diào)（圖2）。各試驗(yàn)組中BN組誘導(dǎo)上調(diào)最為明顯（0.848 9±0.039 6），其表達(dá)量約為空白對(duì)照組（0.137 8±0.028 3）的6倍，約為PBS對(duì)照組（0.456 0±0.163 7）的1.8倍，微生物組誘導(dǎo)上調(diào)幅度均強(qiáng)于物理誘導(dǎo)組。兩組物理?xiàng)l件誘導(dǎo)熱刺激組（0.536 2±0.039 6）表達(dá)量約為正常組的3.9倍，冷

刺激組（0.421 3±0.130 6）表達(dá)量約為正常組的3.1倍，兩組誘導(dǎo)與PBS組的誘導(dǎo)上調(diào)能力相近。不同誘導(dǎo)方式Attacin基因表達(dá)量由高到低為BN組、XY組、JP組、KC組、DC組、LN組、RJ組、PBS組、BD組、空白組。

圖1 不同誘導(dǎo)條件下家蠅幼蟲(chóng)先天性免疫相關(guān)基因PCR電泳圖

表2 不同誘導(dǎo)條件下家蠅幼蟲(chóng)各基因表達(dá)量

圖2 家蠅幼蟲(chóng)Attacin基因表達(dá)情況

2.2.2 Cecropin基因表達(dá) Cecropin基因經(jīng)誘導(dǎo)后均明顯上調(diào)（圖3）。各試驗(yàn)組中BN組誘導(dǎo)上調(diào)最為明顯（0.863 4±0.151 0），其表達(dá)量約為空白對(duì)照組（0.309 3±0.006 3）的2.8倍，約為PBS對(duì)照組（0.594 4±0.159 0）的1.5倍，微生物組誘導(dǎo)上調(diào)幅度均強(qiáng)于物理誘導(dǎo)組。兩組物理?xiàng)l件誘導(dǎo)熱刺激組（0.554 8±0.204 2）表達(dá)量約為正常組的1.8倍，冷刺激組（0.421 3±0.130 6）表達(dá)量與正常組接近，兩組對(duì)Cecropin基因誘導(dǎo)上調(diào)能力均弱于PBS組。不同誘導(dǎo)方式Cecropin基因表達(dá)量由高到低為BN組、XY組、JP組、KC組、DC組、LN組、PBS組、

RJ組、BD組、空白組。

圖3 家蠅幼蟲(chóng)Cecropin基因表達(dá)情況

2.2.3 Defensin基因表達(dá) Defensin基因經(jīng)誘導(dǎo)后均明顯上調(diào)（圖4）。各試驗(yàn)組中XY組誘導(dǎo)上調(diào)最為明顯（0.856 1±0.167 4），其表達(dá)量約為空白對(duì)照組（0.232 9±0.104 7）的3.7倍，約為PBS對(duì)照組（0.578 2±0.085 9）的1.5倍，微生物組誘導(dǎo)上調(diào)幅度均強(qiáng)于物理誘導(dǎo)組。兩組物理?xiàng)l件誘導(dǎo)熱刺激組（0.694 5±0.207 3）表達(dá)量約為正常組的3倍，冷刺激組（0.523 0±0.147 1）表達(dá)量約為正常組的2.2倍，熱刺激組對(duì)Defensin基因誘導(dǎo)上調(diào)能力略強(qiáng)于PBS組；冷刺激組對(duì)該基因的誘導(dǎo)上調(diào)能力略弱于PBS組。不同誘導(dǎo)方式Defensin基因表達(dá)量由高到低為XY組、JP組、BN組、KC組、LN組、DC組、RJ組、PBS組、BD組、空白組。

圖4 家蠅幼蟲(chóng)Defensin基因表達(dá)情況

2.2.4 Diptericin基因表達(dá) Diptericin基因經(jīng)誘導(dǎo)后均明顯上調(diào)（圖5）。各試驗(yàn)組中LN組誘導(dǎo)上調(diào)最為明顯（0.751 7±0.214 5），其表達(dá)量約為空白對(duì)照組（0.275 3±0.050 2）的2.9倍，與PBS對(duì)照組接近，微生物組誘導(dǎo)上調(diào)幅度均強(qiáng)于物理誘導(dǎo)組。兩組物理?xiàng)l件誘導(dǎo)熱刺激組（0.532 3±0.204 1）表達(dá)量約為正常組的1.9倍，冷刺激組（0.499 8± 0.119 4）表達(dá)量約為正常組的1.9倍，兩個(gè)物理誘導(dǎo)組對(duì)Diptericin基因誘導(dǎo)上調(diào)能力與PBS組接近；熱刺激組對(duì)該基因的誘導(dǎo)上調(diào)能力略強(qiáng)于BD組。不同誘導(dǎo)方式Defensin基因表達(dá)量由高到低為L(zhǎng)N組、XY組、KC組、BN組、JP組、DC組、RJ組、PBS組、BD組、空白組。

2.2.5 MAF-1基因表達(dá) MAF-1基因經(jīng)誘導(dǎo)后均明顯上調(diào)（圖6）。各試驗(yàn)組中KC組誘導(dǎo)上調(diào)最為明顯（0.788 2±0.124 8），其表達(dá)量約為空白對(duì)照組（0.490 4±0.202 5）的1.61倍，約為PBS對(duì)照組（0.499 4±0.156 8）的1.58倍，微生物組誘導(dǎo)上調(diào)幅度均強(qiáng)于物理誘導(dǎo)組。兩組物理?xiàng)l件誘導(dǎo)熱刺激組（0.479 9±0.145 5）、冷刺激組（0.276 2±0.122 0）表達(dá)量均表現(xiàn)出下調(diào)趨勢(shì)，其中冷刺激下調(diào)顯著，正常組表達(dá)量是其的1.8倍。不同誘導(dǎo)方式Defensin基因表達(dá)量由高到低為KC組、XY組、BN組、DC組、JP組、LN組、PBS組、空白組、RJ組、BD組。

圖5 家蠅幼蟲(chóng)Diptericin基因表達(dá)情況

圖6 家蠅幼蟲(chóng)MAF-1基因表達(dá)情況

2.2.6 Lysozyme基因表達(dá) Lysozyme基因經(jīng)誘導(dǎo)后均明顯上調(diào)（圖7）。各試驗(yàn)組中KC組誘導(dǎo)上調(diào)最為明顯（0.691 2±0.102 1），其表達(dá)量約為空白對(duì)照組（0.341 7±0.160 4）的2倍，與PBS對(duì)照組接近，微生物組誘導(dǎo)上調(diào)幅度均強(qiáng)于物理誘導(dǎo)組。兩組物理?xiàng)l件誘導(dǎo)熱刺激組（0.291 2±0.119 9）及冷刺激組（0.313 0±0.144 5）表達(dá)量較正常組略微下調(diào)。不同誘導(dǎo)方式Defensin基因表達(dá)量由高到低為KC組、XY組、LN組、JP組、BN組、DC組、PBS

組、BD組、RJ組、空白組。

圖7 家蠅幼蟲(chóng)Lysozyme基因表達(dá)情況

2.2.7 HSP基因表達(dá) HSP基因經(jīng)誘導(dǎo)后均上調(diào)（圖8）。各試驗(yàn)組中LN組誘導(dǎo)上調(diào)最為明顯（0.698 4±0.067 3），其表達(dá)量約為空白對(duì)照組（0.439 3±0.100 5）的1.6倍，微生物組誘導(dǎo)上調(diào)幅度略強(qiáng)于物理誘導(dǎo)組。兩組物理?xiàng)l件誘導(dǎo)熱刺激組（0.588 6±0.026 8）及冷刺激組（0.560 8±0.040 5）表達(dá)量約為正常組的1.3倍，熱刺激組表達(dá)量略強(qiáng)于冷刺激組，兩個(gè)物理誘導(dǎo)組對(duì)HSP基因誘導(dǎo)上調(diào)能力略強(qiáng)于PBS組。不同誘導(dǎo)方式Defensin基因表達(dá)量由高到低為L(zhǎng)N組、BN組、XY組、DC組、JP組、KC組、RJ組、BD組、PBS組、空白組。

圖8 家蠅幼蟲(chóng)HSP基因表達(dá)情況

3 討論

生物體內(nèi)的基因差異性表達(dá)是調(diào)控生命活動(dòng)的重要機(jī)制，不同發(fā)育階段、不同生理狀態(tài)下基因的表達(dá)決定了整個(gè)生命過(guò)程，包括發(fā)育和分化、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、對(duì)逆環(huán)境的反應(yīng)等［9］。不同的物理化學(xué)因子及病原體侵入對(duì)昆蟲(chóng)機(jī)體狀態(tài)造成改變，將激活昆蟲(chóng)的先天性免疫系統(tǒng)引發(fā)昆蟲(chóng)的免疫應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)體內(nèi)相應(yīng)免疫基因表達(dá)，修復(fù)機(jī)體損傷［10-12］，試驗(yàn)結(jié)果顯示物理因子及病原物誘導(dǎo)后各免疫相關(guān)基因表達(dá)量均表現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)，這也說(shuō)明誘導(dǎo)后，家蠅機(jī)體狀態(tài)發(fā)生改變，產(chǎn)生了免疫應(yīng)激反應(yīng)。不同因素作用下，家蠅產(chǎn)生的免疫反應(yīng)程度有所差別。

昆蟲(chóng)熱刺激下，將發(fā)生機(jī)體整體性免疫應(yīng)答，將增加抗菌肽，副肌球蛋白、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、原肌球蛋白、熱休克蛋白、絲氨酸蛋白等基因的轉(zhuǎn)錄［13，14］。本研究結(jié)果顯示，熱刺激下，各靶標(biāo)基因表現(xiàn)出顯著上調(diào)趨勢(shì)。體壁損傷誘導(dǎo)也是一種常用免疫激活的方式，昆蟲(chóng)體壁損傷后，體液外滲，同時(shí)激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，免疫相關(guān)基因大量轉(zhuǎn)錄，修復(fù)損傷并防御外源病原體入侵［16］。本研究結(jié)果顯示在家蠅體壁損傷情況下，各免疫相關(guān)基因顯現(xiàn)出整體動(dòng)員趨勢(shì)。冷刺激降低機(jī)體整體代謝水平，體內(nèi)代謝相關(guān)酶的活性降低，將會(huì)引起昆蟲(chóng)的滯育［17］。試驗(yàn)結(jié)果顯示，MAF-1、溶菌酶、熱休克蛋白基因在冷刺激后表現(xiàn)出下調(diào)的趨勢(shì)，推測(cè)這些基因可能與家蠅整體生理代謝水平還處于一個(gè)恢復(fù)階段有關(guān)，可能待機(jī)體完全回復(fù)正常代謝水平時(shí)，隨之趨于正常表達(dá)水平。而Attacin、Cecropin、Defensin及Diptericin等抗菌肽基因則表現(xiàn)出表達(dá)量升高趨勢(shì)，推測(cè)在機(jī)體處于較低代謝水平時(shí)，主要由抗菌肽基因行使免疫防御功能。

昆蟲(chóng)體液免疫的主要特點(diǎn)是機(jī)體受外源微生物感染后，脂肪體細(xì)胞合成抗菌肽，抗菌肽分泌到血淋巴中殺死入侵的病原體［4］。不同的病原微生物通過(guò)激活不同的信號(hào)通路產(chǎn)生各自的抗菌肽。昆蟲(chóng)先天性免疫信號(hào)通路主要有兩條，一條是由Toll受體介導(dǎo)的信號(hào)通路，它是由革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌激活的；另一條是IMD信號(hào)通路，它是由革蘭氏陰性菌誘導(dǎo)激活的。Toll信號(hào)通路主要調(diào)控Drosomycin基因的表達(dá)；IMD信號(hào)通路主要調(diào)控Drosocin、Diptericin基因的表達(dá)；而Attacin、Defensin、Cecropin基因則受到Toll和IMD信號(hào)通路共同調(diào)控［18-21］。在本研究中，整體水平上微生物誘導(dǎo)均能顯著上調(diào)抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄水平。Diptericin在大腸桿菌和綠色膿桿菌這兩種陰性菌誘導(dǎo)后上調(diào)幅度最為明顯，推測(cè)家蠅Diptericin基因主要是受革蘭氏陰

性菌激活I(lǐng)MD信號(hào)通路所調(diào)控。Attacin、Defensin、Cecropin基因均表現(xiàn)出陰性菌、陽(yáng)性菌及真菌誘導(dǎo)顯著上調(diào)的趨勢(shì)，且真菌和革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)抗菌肽基因誘導(dǎo)上調(diào)能力略強(qiáng)于革蘭氏陰性菌，推測(cè)這3種基因是受到Toll信號(hào)通路調(diào)控和IMD信號(hào)通路調(diào)控，Toll通路調(diào)控起主導(dǎo)作用。

MAF-1是本課題組前期從家蠅血淋巴中分離到的一種具有抗菌活性的生物多肽［22］，前期研究發(fā)現(xiàn)MAF-1基因既是家蠅的免疫分子之一，也是家蠅幼蟲(chóng)發(fā)育有關(guān)的生理因子之一。本研究發(fā)現(xiàn)在冷刺激狀態(tài)下，MAF-1基因顯著下調(diào)，證實(shí)冷刺激下，機(jī)體發(fā)生滯育，MAF-1作為發(fā)育相關(guān)因子同樣受到影響。而在微生物誘導(dǎo)下顯著上調(diào)，也進(jìn)一步證實(shí)MAF-1為家蠅先天性免疫系統(tǒng)中一個(gè)重要組成部分。

溶菌酶（Lysozyme）是一種能水解黏多糖的堿性酶，它能催化細(xì)菌細(xì)胞壁中黏多糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的1，4-糖苷鍵的水解，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁破裂、內(nèi)容物溢出使細(xì)菌死亡，因此它是一種廣譜的抗菌效應(yīng)分子，除此之外它還可以誘導(dǎo)調(diào)節(jié)其他免疫分子的合成和分泌［23］。本研究中，在外源微生物沒(méi)有入侵家蠅體內(nèi)時(shí)，溶菌酶基因較低水平表達(dá)。當(dāng)家蠅體壁受到機(jī)械性損傷和微生物入侵時(shí)，溶菌酶基因表達(dá)水平迅速上調(diào)。推測(cè)可能微生物入侵能快速激活溶菌酶基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄。在兩種物理因子刺激下，與正常對(duì)照組相比，溶菌酶基因表達(dá)未表現(xiàn)出顯著差異，推測(cè)溶解酶在機(jī)體內(nèi)主要發(fā)揮清除入侵微生物，保護(hù)機(jī)體作用。

熱休克蛋白（HSP）是昆蟲(chóng)應(yīng)激代謝及免疫應(yīng)答過(guò)程中產(chǎn)生的一類重要蛋白質(zhì)，它們主要作用是協(xié)助蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)輸，放置蛋白質(zhì)前體積累并刺激蛋白轉(zhuǎn)移，在應(yīng)激情況下能起到穩(wěn)定多肽鏈，防止其失活，起到保護(hù)機(jī)體的作用。結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn)在HSP基礎(chǔ)代謝水平較高，在物理因子刺激下，HSP表達(dá)水平上調(diào)，推測(cè)其可能在機(jī)體應(yīng)激恢復(fù)中對(duì)多種功能性蛋白質(zhì)、酶類發(fā)揮協(xié)同作用，幫助機(jī)體回復(fù)正常狀態(tài)。在經(jīng)微生物誘導(dǎo)后，HSP轉(zhuǎn)錄水平明顯增高，推測(cè)其可能協(xié)助、參與機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，同多種抗菌分子共同作用，保護(hù)機(jī)體，清除病原微生物。

4 結(jié)論

家蠅幼蟲(chóng)先天性免疫系統(tǒng)中，抗菌肽及其他免疫相關(guān)基因發(fā)揮重要作用。微生物及物理因子刺激均能激活家蠅的免疫系統(tǒng)，在不同條件刺激下，家蠅幼蟲(chóng)機(jī)體免疫應(yīng)激反應(yīng)不同。微生物誘導(dǎo)免疫應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)于物理因子誘導(dǎo)；各種微生物誘導(dǎo)條件下，革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌激活免疫系統(tǒng)能力最強(qiáng)。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Expression Analysis of Immune Genes at Different Induction Conditions of Third Instar Larvae of Musca domestica

Xiu Jiangfan Wei Chuanchuan Chen Mingming Wu Jianwei
（Guiyang Medical University，Guiyang 550004）

We studied on the innate immune gene expression at different induction conditions of third instar larvae of Musca domestica. We chose the cold, heat stimulation and gram negative bacteria, gram positive bacteria and fungi induced the third instar larvae, 12 hours after the total RNA was extracted from third instar larvae.We designed the primers according to the published GenBank glyceraldehyde phosphate dehydrogenase（GAPDH）, Attacin, Cecropin, Defensin, Diptericin, Lysozyme, heat shock protein（HSP）and Musca antifungal peptide（MAF-1）gene sequences of housefly. We were using the GAPDH as reference gene. Analysed the gene expression in different inducing conditions of third instar larvae of housefly through RT-PCR reaction. Results showed that in different inducing conditions, the genes related innate immunity expression showed large differences. Microbial stimulation showed the higher levels of gene expression than physical stimulation. The gene expression induction of fungi and positive bacteria was the highest, the cold stimulation induced the lowest. The innate immune system of the housefly larvae could activate by both microbial and physical stimulation. In different conditions of stimulation, the body’s immune response to different stress.

Musca domestica Induction Innate immunity Gene expression

2013-12-10

修江帆，男，講師，博士研究生，研究方向：昆蟲(chóng)分子免疫；E-mail：156735385@qq.com

吳建偉，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：昆蟲(chóng)免疫學(xué)及生物活性物質(zhì)利用研究；E-mail：wjw@gmc.edu.cn