鄧平平 施永海 張根玉 張之文 張海明 陸根海 劉永士

（上海市水產研究所，上海 200433）

磁珠富集法分離刀鱭微衛(wèi)星標記

鄧平平 施永海 張根玉 張之文 張海明 陸根海 劉永士

（上海市水產研究所，上海 200433）

利用磁珠富集法分離微衛(wèi)星序列，以開發(fā)長江刀鱭微衛(wèi)星分子標記。將長江刀鱭基因組DNA經(jīng)限制內切酶Mse I酶切，回收400-1 000 bp片段，安裝接頭，構建長江刀鱭全基因組PCR文庫。用生物素標記的微衛(wèi)星探針（CA）12與其雜交，磁珠富集含有微衛(wèi)星序列的 DNA片段。將洗脫所得片段進行PCR擴增，然后進行克隆。經(jīng)過菌落PCR檢驗后挑選出118個陽性克隆進行測序，其中97條含有微衛(wèi)星序列。用設計合成59對微衛(wèi)星引物對30尾養(yǎng)殖長江刀鱭進行引物的多態(tài)性篩選，得到9對多態(tài)性引物。

刀鱭 磁珠富集 微衛(wèi)星 多態(tài)性

刀鱭（C. ectenes）隸屬于鯡形目（Clupeiforms）鳀科（Engraulidae）鱭屬（Coilia），是一種小型的洄游鳀科魚類，主要分布在我國長江中下游及沿海河口流域，因其肉味鮮美有“長江三鮮”之首的美譽。由于長江流域自20世紀70年代以來受過度捕撈、水利工程修建、生活和工業(yè)污水的排放以及水運發(fā)展等因素的影響，刀鱭的生殖洄游通路被阻斷，生活水環(huán)境被污染，長江刀鱭的產量和種群數(shù)量極具減少，難再形成漁汛。

刀鱭的研究早期集中在漁業(yè)資源［1，2］、年齡、生長［3］、胚胎發(fā)育和洄游［4］方面，后期開展了一系列同工酶［5］、線粒體基因（Dloop［6］、cytb［7］、16S rRNA［8］）、RAPD-PCR［9，10］和ISSR-PCR［10］技術對鳀科魚類進行的遺傳多樣性和分類研究。目前刀鱭微衛(wèi)星標記的開發(fā)和運用報道不多，僅限于Ma［11］和Chen［12］對此做過研究。本研究運用磁珠富集的方法篩選新的刀鱭微衛(wèi)星分子標記，以期為刀鱭養(yǎng)殖品系的優(yōu)化、遺傳多樣性的檢測及遺傳圖譜構建提供更有效的研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料

30尾長江刀鱭來自上海市水產研究所苗種技術中心養(yǎng)殖品種。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 取長江刀鱭肌肉于無水乙醇中固定，-20℃保存。長江刀鱭基因組DNA提取采用傳統(tǒng)的苯酚/氯仿法［13］，將獲得的DNA溶

于滅菌的無菌水中，使用前需瓊脂糖檢測及紫外分光光度計定量，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 長江刀鱭基因組文庫的構建

1.2.2.1 基因組DNA的酶切、回收及連接 在37℃水浴鍋中使用限制性內切酶MseI將100 μg長江刀鱭基因組DNA酶切4 h，1%瓊脂糖電泳后，切割回收400-1 000 bp大小的基因片段。取4 μL酶切產物，1 μL接頭MA：5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'（MA1和MA2混合產物），5 μL SolutionⅡ和10 μL SolutionⅠ在16℃連接過夜。

1.2.2.2 擴增接頭連接的DNA片段 以酶切連接好的產物為模板，以MA：5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'為引物進行擴增，PCR反應條件為：94℃變性5 min；94℃ 30 s，53℃ 1 min，72℃ 1 min，循環(huán)20次；72℃延伸5 min。取5 μL PCR產物進行瓊脂糖電泳檢測，判斷擴增產物的分布范圍以及產量。

1.2.3 微衛(wèi)星序列的富集

1.2.3.1 雜交 根據(jù)預試驗的摸索建立100 μL的反應體系，1 μL（100 μmol/L）探針（為BSSR-l：5'-bio-CACACACACACACACACACACACA-3'）、21 μL 20×SSC、0.7 μL 10% SDS、67.3 μL滅菌ddH2O?；旌暇鶆蚝螅?5℃反應5 min，58℃放置15 min。在雜交中同時進行磁珠的平衡處理。

1.2.3.2 磁珠的處理 將磁珠溶液輕搖均勻，吸出100 μL移至1.5 mL離心管中，并加入1 mL TEN100，混勻清洗磁珠2 min后置于磁性分離架上約1 min，輕輕吸出透明液體，重復以上步驟至少兩次，直至磁珠順滑再加入40 μL TEN100，同時加入變性的質粒DNA以封閉磁珠表面。

1.2.3.3 磁珠吸附富集 將雜交產物與平衡封閉處理后的磁珠進行混合，加入300 μL TEN100，室溫放置30 min，并輕搖混勻。

1.2.3.4 洗滌與洗脫 將磁珠富集的產物進行3次松弛性洗滌（使用TEN1000進行洗滌），再進行3次嚴謹性洗滌（使用0.2×SSC+0.1% SDS洗滌）。向洗滌好的磁珠中加入50 μL TE緩沖液，混勻并95℃加熱10 min，在磁力架上迅速分離透明液體作為第一次洗脫液。再向磁珠中加入12 μL 0.15 mol/L的NaOH，輕柔混勻，用磁力架分離透明液體，并加入1.8 μL 1 mmol/L的HCl，加入36.2 μL TE使體積補足為50 μL，作為第二次洗脫液。先后分別回收二次洗脫產物以作備用。

1.2.3.5 洗脫產物的擴增及回收 分別以兩次洗脫產物為模板，MA為引物，PCR程序為：94℃變性5 min；94℃ 30 s，53℃ 1 min，72℃ 1 min，30個循環(huán)；并在72℃延伸5 min。將兩種PCR產物在1%瓊脂糖中電泳，切下片段大小在400-1 000 bp的膠段，回收切割片段并在1%瓊脂糖中電泳檢測回收效率。

1.2.3.6 連接與轉化 建立10 μL連接反應體系，1 μL pMD18-T（50 ng/μL）、插入片段2 μL、SolutionⅠ5 μL、2 μL ddH2O在16℃水浴連接4 h以制備充足質粒。在CaCl2制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5α轉化下，最終得到長江刀鱭微衛(wèi)星文庫。用載體通用引物M13（-47與-48）和SSR01對每個菌落進行3次PCR，挑選出陽性克隆送出測序。

1.2.4 微衛(wèi)星序列引物設計及多態(tài)性引物篩選 運用常規(guī)引物設計技巧［14］對測出含有微衛(wèi)星片段的序列利用Primer Premier 5.0設計59對引物，并對采取的30尾長江刀鱭樣品進行引物多樣性的篩選。

2 結果

2.1 酶切及其產物連接后PCR擴增

以長江刀鱭基因組DNA為底物進行MseI酶切，將酶切產物與接頭連接，檢測其PCR產物可見一片分布比較均勻的片段，片段的大小主要集中在300-1 000 bp（圖1）。

圖1 基因組酶切電泳圖

2.2 菌落PCR檢驗重組率

在CaCl2制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5α轉化下，得到長江刀鱭基因組文庫共800個克隆，挑選了其中的170個菌落進行菌落PCR檢驗，得到陽性克隆118個（陽性克隆率約為69.41%）。

2.3 測序結果

對挑選出的118個陽性克隆進行測序，有97個（82.81%）克隆含有微衛(wèi)星片段，這97個含有微衛(wèi)星的克隆中含有微衛(wèi)星位點共計271個，其中以AC/TG為重復基元的微衛(wèi)星序列最多為221個（81.55%），AG/CT次之為48個（17.71%）。重復次數(shù)在10-20間的68個（25.09%），最高重復次數(shù)為55次。其中完美型微衛(wèi)星156個，非完美型44個，復合完美型12個（表1）。從測序結果發(fā)現(xiàn)，除了出現(xiàn)對應探針CA重復基元外，還獲得了GA、TC、GAG、AAC和ACGC重復基元。已在GenBank登錄92條（登錄號：KF62219、KF682220、KF690275-KF690364）。

表1 長江刀鱭微衛(wèi)星的不同類型所占比例

2.4 引物設計與篩選

在所測得的97條含有微衛(wèi)星序列中，排除了不符合引物設計條件［14］的序列，利用引物設計軟件Primer premier 5.0共設計59對引物，并以上海水產研究所養(yǎng)殖的30尾長江刀鱭基因組DNA為模板分別進行PCR擴增，其中有9對引物對本次采樣表現(xiàn)出多態(tài)性，能夠作為長江刀鱭微衛(wèi)星分子標記。利用溫度梯度PCR方法，摸索出這9對引物的最佳退火溫度，具體信息列于表2。

表2 9對SSR引物對長江刀鱭多態(tài)性檢測結果

3 討論

3.1 開發(fā)微衛(wèi)星分子標記的途徑

隨著分子標記技術的發(fā)展，微衛(wèi)星分子標記在群體結構、遺傳學分析、基因鑒定、生物多態(tài)性分析等方面逐漸展現(xiàn)出它的優(yōu)勢，而它的開發(fā)一度成為分子生物學領域的研究熱點［15］。目前微開發(fā)衛(wèi)星分子標記主要有2種途徑：一種是對已經(jīng)公布的序列數(shù)據(jù)作相應的處理或者直接借用，如對EMBL、GenBank和DDBJ［16］等DNA序列數(shù)據(jù)庫檢索出的微衛(wèi)星片段進行引物設計和篩選獲得微衛(wèi)星分子標記，以及借用相鄰品種已經(jīng)開發(fā)出的微衛(wèi)星分子標記。這種方法雖然簡單且資金投入少，但是可檢索的資源相對有限，特別是對于一些尚未開展相關研究的品種此法難易實施。另一種是先構建一個全基因文庫，然后通過雜交篩選出需要的微衛(wèi)星序列。因雜交的方式和探針的類別不同分為非放射性或放射性標記探針的Southern雜交與寡核苷酸探針的磁珠富集法。由于磁珠富集法具有效率高、人力和資金投入少以及耗時少等明顯優(yōu)勢而被科研工作者普遍采用。本研究通過磁珠富集法得到長江刀鱭基因組文庫共800個克隆，挑選了其中的170個菌落進行菌落PCR檢驗，得到陽性克隆118個，陽性克隆率約為69.41%。這比用經(jīng)典的構建和篩選小插入片段基因組文庫的方法［17，18］分離含微衛(wèi)星序列的陽

性克隆率（1%-3%）要高出很多。

3.2 運用磁珠富集法需要注意的關鍵環(huán)節(jié)

雖然運用磁珠富集法篩選微衛(wèi)星序列有諸多優(yōu)勢，但整個過程環(huán)節(jié)卻不少，特別是關鍵環(huán)節(jié)的把握。如探針與連接產物的雜交、磁珠的平衡以及洗滌與洗脫，這些都關系到磁珠富集含有微衛(wèi)星序列的效率。本試驗嚴控以上幾個關鍵點，使陽性克隆率達到69.41%，這優(yōu)于大部分同類試驗［19-24］，但比薛華柏［25］對小黃李的研究低。另外，由于磁珠富集環(huán)節(jié)較多，各環(huán)節(jié)間又相互依存，特別是相鄰環(huán)節(jié)更要注意檢測分析結果，以便更穩(wěn)更快地開展試驗。在酶切回收以及洗脫產物的擴增回收過程中，由于其他原因本試驗沒有采用低熔點膠而是采用常規(guī)瓊脂糖膠，從最終的結果看還是可行的，但回收的效率不是很高。

3.3 多態(tài)性引物篩選時樣本的選取問題

通過磁珠富集法獲得了97條微衛(wèi)星序列并以此設計了59對引物，以人工繁殖的30尾長江刀鱭為模板進行引物的行多態(tài)性篩選，最終只獲得了9對多態(tài)性引物，且有6對引物表現(xiàn)出單態(tài)性，有10對引物沒有擴增出產物，另外24對引物擴增的效果不理想。出現(xiàn)單態(tài)性引物偏多可能有兩方面的原因：一是設計合成的引物對長江刀鱭這個品種只表現(xiàn)單態(tài)性，二是本試驗所使用的樣本是人工繁育群體，可能存在一定的近親繁殖現(xiàn)象［26］。

4 結論

經(jīng)過磁珠富集后，得到118個陽性克隆，其中97個陽性克隆含有微衛(wèi)星序列。在獲得含有微衛(wèi)星序列的基礎上設計合成59對引物，并對30尾養(yǎng)殖長江刀鱭進行引物的多態(tài)性篩選，最終得到9對多態(tài)性引物，為長江刀鱭的多樣性分析提供一定的幫助。

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（責任編輯 馬鑫）

Isolation of Microsatellite in C. ectenes by Magnetic Beads

Deng Pingping Shi Yonghai Zhang Genyu Zhang Zhiwen Zhang Haiming Lu Genhai Liu Yongshi
（Shanghai Fisheries Research Institute，Shanghai 200433）

It was a study to develop microsatellite markers with the method of microsatellite enrichment by magnetic beads. Genomic DNA of C. ectenes was digested with restriction enzyme Mse I. The fragments of 400-1 000 bp were recycled and ligated with relevant adaptors, then the “complete genome PCR library” was constructed. The PCR products were hybridized by a biotin-labeled Oligo probe（CA）12, the microsatellites were enriched with magnetic beads. The eluted fragments from magnetic beads were amplified and cloned into pMD18-T vector. 118 positive clones were screened with PCR method from 170 clones. After sequenced, 97 microsatellite sequences were found, 59 pairs of SSR primers were designed, and 9 pairs of primers were polymorphism within 30 cultured Chang Jiang C. ectenes.

C. ectenes Enrichment by magnetic beads Microsatellite Polymorphism

2013-09-27

上海市科委重點科技公關項目（11391901300），科技部與上海市共同重大任務科研專項（12dz1909302）

鄧平平，男，助理工程師，研究方向：水產養(yǎng)殖和育種工作；E-mail：kokou365@sohu.com