盧婷， 王晨， 杜超， 劉姝， 沈詠梅， 張修月， 岳碧松*

(1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610064；2.四川省藥用動(dòng)物工程技術(shù)研究中心，成都610081)

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林麝全基因組微衛(wèi)星分布規(guī)律研究

盧婷1#， 王晨1#， 杜超1， 劉姝2， 沈詠梅2， 張修月1， 岳碧松1*

(1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610064；2.四川省藥用動(dòng)物工程技術(shù)研究中心，成都610081)

林麝Moschusberezovskii是中國(guó)重要的資源動(dòng)物，也是國(guó)家Ⅰ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物。本研究使用生物信息學(xué)方法，分析林麝全基因組中完美型微衛(wèi)星的分布特征。在林麝2.53 Gb的基因組序列中，共搜索到665 524個(gè)完美型微衛(wèi)星，總長(zhǎng)度為11 517 784 bp，占基因組序列總長(zhǎng)度的0.42%，總豐度為244個(gè)/Mb。林麝基因組中，單堿基微衛(wèi)星序列數(shù)量最多，為221 058個(gè)，約占總微衛(wèi)星數(shù)的33.22%，豐度為81.05個(gè)/Mb，然后依次為二堿基、五堿基、三堿基、四堿基、六堿基重復(fù)類(lèi)型微衛(wèi)星。林麝基因組中數(shù)目最多的10種微衛(wèi)星類(lèi)別依次為：A、AACTG、AGC、AC、AT、AG、AAAT、AAC、AAT和AAAC，占所有基因組微衛(wèi)星的93.2%，表現(xiàn)出明顯的A、T偏好。林麝基因組微衛(wèi)星序列分布研究表明，其在外顯子(2 530個(gè))上的分布數(shù)量遠(yuǎn)低于內(nèi)含子(200 906個(gè))和基因間隔區(qū)(454 596個(gè))，與前人關(guān)于微衛(wèi)星在非編碼區(qū)的分布多于編碼區(qū)的結(jié)論一致。本研究為深入研究林麝基因組特征及篩選更多優(yōu)良微衛(wèi)星標(biāo)記提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

林麝；全基因組；微衛(wèi)星；分布規(guī)律

微衛(wèi)星序列由核心序列和側(cè)翼序列組成，其核心序列由l～6個(gè)核苷酸基序串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成(蔣雪梅等，2015)。微衛(wèi)星廣泛分布于真核生物、原核生物和病毒的基因組中(Tautz，1989；李午佼等，2014)，除分布于基因組的非編碼區(qū)(如內(nèi)含子和基因間隔區(qū))外，也存在于編碼區(qū)(Ellegren，2004；Huangetal.，2015)。微衛(wèi)星核心序列的重復(fù)數(shù)具有高可變性，使其在不同個(gè)體中有差異，并且同一位點(diǎn)在不同個(gè)體中存在多個(gè)等位基因(李玉芝，2012)，因而微衛(wèi)星具有高度多態(tài)性。但微衛(wèi)星的側(cè)翼序列相對(duì)保守，可以根據(jù)它的保守性設(shè)計(jì)引物，再通過(guò)PCR方法對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增得到微衛(wèi)星標(biāo)記。微衛(wèi)星不僅在基因組中分布廣泛、多態(tài)性高，而且還具有雜合子比率高、選擇中性、共顯性遺傳、分析方法簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于遺傳圖譜構(gòu)建(Massaultetal.，2010)、親緣關(guān)系鑒定(Serbezovetal.，2010)、種群遺傳多樣性分析(戚文華等，2014)等研究。

林麝Moschusberezovskii隸屬于偶蹄目Cetartiodactyla麝科Moschidae麝屬M(fèi)oschus。成體雄麝香腺囊分泌的麝香具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值(Mengetal.，2006)，野外亂捕濫獵猖獗，加之其棲息地破壞，野生林麝已經(jīng)瀕臨滅絕(王淯等，2006；Huangetal.，2013)。我國(guó)20世紀(jì)50年代開(kāi)始人工飼養(yǎng)研究，取得了可喜成果，但存在管理粗放、近交退化、疾病多、繁殖力低等問(wèn)題，阻礙了人工養(yǎng)麝業(yè)的正常發(fā)展(王淯等，2006；Sheng & Liu，2007；許珂等，2013)。本研究在完成林麝全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，對(duì)微衛(wèi)星序列特征和分布規(guī)律進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)進(jìn)一步篩選高質(zhì)量的林麝微衛(wèi)星分子標(biāo)記和林麝分子遺傳學(xué)研究具有重要意義。

1 研究方法

1.1數(shù)據(jù)來(lái)源

林麝基因組大小為2.53 Gb，文件為FASTA格式，由北京諾禾致源生物信息科技有限公司測(cè)序，本實(shí)驗(yàn)室組裝和注釋。

1.2微衛(wèi)星搜索

使用本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星搜索統(tǒng)計(jì)軟件MSDBv2.4(Duetal.，2013)，從林麝基因組中掃描搜索微衛(wèi)星序列。設(shè)置的統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)重復(fù)次數(shù)，單堿基微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)為12次及以上，二堿基和三堿基微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)分別為7次和5次及以上，四、五、六堿基微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)為4次及以上；(2)重復(fù)序列的側(cè)翼序列長(zhǎng)度大于200 bp。

1.3微衛(wèi)星定位

根據(jù)林麝基因組的注釋信息，使用本實(shí)驗(yàn)室編寫(xiě)的Python腳本對(duì)搜索到的微衛(wèi)星序列進(jìn)行定位，判斷微衛(wèi)星在基因組的具體位置。

2 結(jié)果

2.1不同重復(fù)類(lèi)型的微衛(wèi)星的總體分布特征

在林麝2.53 Gb的基因組序列中搜索到完美型微衛(wèi)星序列總數(shù)為665 524個(gè)；重復(fù)序列總長(zhǎng)度為11 517 784 bp，占基因組序列總長(zhǎng)度的0.42%；總豐度為244個(gè)/Mb。

不同重復(fù)類(lèi)型微衛(wèi)星的數(shù)量分布特征如表1所示：林麝基因組中，單堿基微衛(wèi)星序列數(shù)量最多，為221 058個(gè)，約占微衛(wèi)星總數(shù)的33.22%，豐度為81.05個(gè)/Mb；其次是二堿基微衛(wèi)星，為144 258個(gè)，約占微衛(wèi)星總數(shù)的21.68%，豐度為52.89個(gè)/Mb；六堿基微衛(wèi)星數(shù)目最少，為567個(gè)，只占微衛(wèi)星總數(shù)的0.09%，豐度為0.21個(gè)/Mb。

表1 微衛(wèi)星各重復(fù)類(lèi)型的數(shù)目、總長(zhǎng)度、比例和豐度Table 1 The number， percent and abundance of microsatellites in different types of repeats

注： 重復(fù)類(lèi)型中的Mono-， Di-， Tri-， Tetra-， Pentra-和Hexa-的后綴都是nucleotide。

Notes: The suffix of Mono-， Di-， Tri-， Tetra-， Pentra-and Hexa- is nucleotide.

2.2各重復(fù)類(lèi)型微衛(wèi)星核心序列重復(fù)次數(shù)分布

林麝基因組中，不同類(lèi)型微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)范圍有較大的差異。單堿基微衛(wèi)星的重復(fù)次數(shù)主要分布在12～16次，數(shù)量占單堿基微衛(wèi)星總數(shù)的88.90%，重復(fù)12次的數(shù)目高達(dá)65 000個(gè)，最高重復(fù)次數(shù)為733次；二堿基微衛(wèi)星序列重復(fù)拷貝數(shù)主要分布在7～10次，數(shù)量占二堿基微衛(wèi)星總數(shù)的77.69%，重復(fù)7次的二堿基微衛(wèi)星最多，有51 305個(gè)，最高重復(fù)次數(shù)達(dá)1 560次；三堿基微衛(wèi)星重復(fù)拷貝數(shù)主要分布在5～7次，占95.56%，重復(fù)5次的數(shù)量超過(guò)了三堿基微衛(wèi)星總數(shù)一半，為67 308個(gè)，最高重復(fù)次數(shù)為175次；四堿基微衛(wèi)星中，4次重復(fù)拷貝的微衛(wèi)星數(shù)目最多，為3 224個(gè)，占所有四堿基微衛(wèi)星總數(shù)的82.65%，最高重復(fù)次數(shù)為437次；五堿基微衛(wèi)星數(shù)目最多的也是4次重復(fù)拷貝，達(dá)100 000個(gè)，占所有五堿基微衛(wèi)星數(shù)量的73.22%，最高重復(fù)次數(shù)為111次；在總數(shù)只有567個(gè)的六堿基微衛(wèi)星中，其重復(fù)拷貝數(shù)在4～26次，但重復(fù)4次的六堿基微衛(wèi)星超過(guò)了450個(gè)，占六堿基微衛(wèi)星總數(shù)的83.07%，最高重復(fù)次數(shù)為26次。6種重復(fù)類(lèi)型微衛(wèi)星的最高重復(fù)次數(shù)所對(duì)應(yīng)的微衛(wèi)星數(shù)量都為1個(gè)，且重復(fù)次數(shù)與微衛(wèi)星數(shù)量表現(xiàn)出隨著重復(fù)次數(shù)的增加，微衛(wèi)星數(shù)量逐漸減少的趨勢(shì)。

2.3含量豐富的微衛(wèi)星類(lèi)別

林麝基因組微衛(wèi)星序列中，除了不同重復(fù)類(lèi)型的微衛(wèi)星數(shù)量差異明顯外，同種微衛(wèi)星類(lèi)型不同類(lèi)別的數(shù)量也有很大差別(表2)。在單堿基和五堿基微衛(wèi)星中，A和AACTG重復(fù)序列數(shù)量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，分別占同類(lèi)微衛(wèi)星數(shù)量的98.67%和95.46%；其余4種微衛(wèi)星類(lèi)型中最多的重復(fù)拷貝類(lèi)別分別為：AC、AGC、AAAT和AACCCT。除六堿基微衛(wèi)星外，單堿基至五堿基微衛(wèi)星都表現(xiàn)出一種重復(fù)拷貝類(lèi)別數(shù)量占明顯優(yōu)勢(shì)的結(jié)果，如三堿基微衛(wèi)星中，AGC重復(fù)類(lèi)別數(shù)量為97 662個(gè)，占三堿基微衛(wèi)星總數(shù)(120 319)的81.17%，遠(yuǎn)超過(guò)剩下所有重復(fù)類(lèi)別的總和。所有微衛(wèi)星重復(fù)類(lèi)別中，數(shù)目最多的10種依次為：A(32.77%)，AACTG(20.13%)，AGC(14.67%)，AC(14.00%)，AT(5.92%)，AG(1.70%)，AAAT(1.66%)，AAC(0.81%)，AAT(0.80%)和AAAC (0.72%)，有明顯的A、T偏好。這10種重復(fù)拷貝類(lèi)別的數(shù)量都大于4 500個(gè)，占所有基因組微衛(wèi)星總數(shù)的93.2%。

表2 二堿基至六堿基微衛(wèi)星數(shù)目最多的重復(fù)拷貝類(lèi)別Table 2 The most frequent microsatellite motifs in 2-6 repeats

2.4微衛(wèi)星在基因組上的分布特征

林麝基因組微衛(wèi)星在基因組上的定位結(jié)果表明，共有203 375個(gè)微衛(wèi)星分布在基因上，在基因間區(qū)的有454 596個(gè)。對(duì)分布在基因上的微衛(wèi)星進(jìn)一步定位分析，結(jié)果如表3，有2 530個(gè)微衛(wèi)星在外顯子上，占基因上微衛(wèi)星總數(shù)的0.38%，包括1～6堿基微衛(wèi)星個(gè)數(shù)分別為：27、19、2 363、22、16和83個(gè)。外顯子上三堿基微衛(wèi)星數(shù)量最多，共由10種三堿基微衛(wèi)星重復(fù)拷貝類(lèi)別組成：CCG(702)，AGC(630)，AGG(398)，ACC(396)，ATC(107)，AAG(66)，AAC(33)，ACG(26)，AAT(3)和ACT(2)。除ATC與ACT對(duì)應(yīng)的是終止密碼子外，其余8種都是氨基酸密碼子，它們所對(duì)應(yīng)的氨基酸分別是：CCG-Gly，AGC-Ser，AGG-Ser，ACC-Trp，AAG-Phe，AAC-Leu，ACG-Cys和AAT-Leu。內(nèi)含子上有200 906個(gè)微衛(wèi)星，占基因上微衛(wèi)星總數(shù)的30.53%，其數(shù)量遠(yuǎn)多于外顯子微衛(wèi)星的數(shù)量。內(nèi)含子中最多的微衛(wèi)星重復(fù)類(lèi)型是單堿基微衛(wèi)星，共有72 718個(gè)，占33.19%，其次是二堿基微衛(wèi)星和三堿基微衛(wèi)星。

3 討論

本研究以實(shí)驗(yàn)室組裝的林麝基因組序列為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)方法對(duì)林麝基因組中完美型微衛(wèi)星序列進(jìn)行搜索統(tǒng)計(jì)。微衛(wèi)星序列含量分析表明，林麝的微衛(wèi)星序列占基因組比例(0.42%)與哺乳綱Mammalia物種如牛Bostaurus(0.48%)、綿羊Ovisaries(0.48%)(戚文華等，2013)、牦牛Bosgrunniens(0.47 %)(Ma，2015)等物種基本一致，而低于大熊貓Ailuropodamelanoleuca(0.64%)、北極熊Ursusmaritimus(0.79%)(李午佼等，2014)、人類(lèi)Homosapiens(3%)(Subramanianetal.，2003)和小鼠Musmusculus(2.85%)(童曉玲等，2006)。此結(jié)果與王月月等(2015)的研究一致，他們認(rèn)為，親緣關(guān)系越近，物種基因組微衛(wèi)星特征越相似。

表3 微衛(wèi)星在基因內(nèi)外的數(shù)量分布Table 3 Number， percentage， and relative abundanceof microsatellites in different regions

研究表明，不同物種基因組微衛(wèi)星的數(shù)量、重復(fù)類(lèi)型、密度等都存在很大差別(Websteretal.，2002；汪自立等，2013)。林麝基因組微衛(wèi)星中單堿基微衛(wèi)星數(shù)量占優(yōu)勢(shì)(33.22%)，這與牛、綿羊(戚文華等，2013)、牦牛(Ma，2015)等物種基因組中優(yōu)勢(shì)微衛(wèi)星類(lèi)型相同。在嚙齒類(lèi)和節(jié)肢動(dòng)物基因組中，二堿基微衛(wèi)星數(shù)量占優(yōu)勢(shì)，而酵母Saccharomycescerevisiae和絲狀真菌Neurosporacrassa(黃杰等，2012)等基因組中，三堿基微衛(wèi)星占主導(dǎo)地位。

在林麝基因組微衛(wèi)星中，6種堿基重復(fù)類(lèi)型都表現(xiàn)出同種重復(fù)類(lèi)型的微衛(wèi)星隨著微衛(wèi)星核心序列重復(fù)次數(shù)的增加，其對(duì)應(yīng)的微衛(wèi)星數(shù)量逐步減少的趨勢(shì)，如單堿基微衛(wèi)星主要集中在重復(fù)12～16次，而最高重復(fù)數(shù)733次的單堿基微衛(wèi)星只有1個(gè)，從而使單堿基微衛(wèi)星序列的長(zhǎng)度主要集中在12～16 bp。這個(gè)規(guī)律與Ellegren(2000)的研究相符，他們認(rèn)為在基因座上，長(zhǎng)等位基因傾向于變短，從而阻止微衛(wèi)星長(zhǎng)度的無(wú)限增長(zhǎng)，因此微衛(wèi)星序列的長(zhǎng)度一般會(huì)維持在一定范圍內(nèi)。這可能與微衛(wèi)星的穩(wěn)定性有關(guān)，隨著微衛(wèi)星長(zhǎng)度的增加，其穩(wěn)定性會(huì)下降(Wierdletal.，1997)，而長(zhǎng)微衛(wèi)星數(shù)量不多可能是由于它們有下調(diào)的突變偏好且存在時(shí)間短(Harr & Schl?tterer，2000)。

微衛(wèi)星在林麝基因組中的分布也有差異，其在外顯子(2 530個(gè))上的分布數(shù)量遠(yuǎn)低于非編碼區(qū)，如內(nèi)含子(200 906個(gè))和基因間隔區(qū)(454 596個(gè))，此結(jié)果支持前人關(guān)于微衛(wèi)星在非編碼區(qū)的分布多于編碼區(qū)的結(jié)論(Ellegren，2004)。外顯子所有微衛(wèi)星序列中，三堿基微衛(wèi)星數(shù)量最為豐富，占外顯子微衛(wèi)星總數(shù)的93.40%，這可能是編碼區(qū)中非三堿基微衛(wèi)星類(lèi)型的突變會(huì)導(dǎo)致移碼突變，而生物的選擇作用將會(huì)減少這些非三堿基微衛(wèi)星的固定，從而減少其含量(Metzgaretal.，2000；Doyleetal.，2013)。

微衛(wèi)星作為遺傳標(biāo)記的應(yīng)用實(shí)踐表明，相對(duì)于二堿基、三堿基微衛(wèi)星，四堿基微衛(wèi)星位點(diǎn)在PCR過(guò)程中，不易出現(xiàn)滑帶(stutter bands)或陰影帶(shadow bands)，相對(duì)能產(chǎn)生更穩(wěn)定、更精確的基因分型結(jié)果(Archieetal.，2003；Lietal.，2010)。然而，目前已公布的微衛(wèi)星標(biāo)記全部為二堿基微衛(wèi)星(Zouetal.，2005；Xiaetal.，2006；Zhangetal.，2007；Zhaoetal.，2008)。根據(jù)林麝基因組四堿基微衛(wèi)星序列分析結(jié)果，共搜索到四堿基微衛(wèi)星38 989個(gè)，但絕大多集中在低重復(fù)次數(shù)(重復(fù)4次)，重復(fù)5次以上的很少，林麝四堿基微衛(wèi)星數(shù)量有限，這是到目前為止分離篩選得到的高質(zhì)量四堿基微衛(wèi)星分子標(biāo)記較少的重要原因。

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DistributionRegularityofMicrosatellitesinMoschusberezovskiiGenome

LU Ting1#， WANG Chen1#， DU Chao1， LIU Shu2， SHEN Yongmei2， ZHANG Xiuyue1， YUE Bisong1*

(1. Sichuan Key Laboratory of Conservation Biology on Endangered Wildlife， College of Life Sciences， Sichuan University，Chengdu 610064， China； 2. Sichuan Medicinal Animal Engineering Technology Research Center， Chengdu 610081， China)

Forest musk deer (Moschusberezovskii) is a critically endangered species. Perfect microsatellite number and distribution regularity of microsatellites in forest musk deer genome were analyzed by microsatellite search tool. A repertoire of 665 524 perfect SSRs with 1-6 bp nucleotide motifs accounting for 0.42% of forest musk deer genome (2.53 Gb) were scanned， and the abundance of microsatellites was 244 no./Mb. Mono-nucleotide was the most abundant category with the highest relative abundance (81.05 no./Mb)， accounting for 33.22% of all the SSRs， followed by di-nucleotide (21.68%)， pentra-nucleotide (21.09%)， tri-nucleotide (18.08%)， tetra-nucleotide (5.86%), and hexa-nucleotide (0.09%). The most abundant microsatellite repeats in forest musk deer genome were A， AACTG， AGC， AC， AT， AG， AAAT， AAC， AAT， and AAAC， totally accounting 93.2% of the scanned microsatellites and showed an apparent A and T preference. The number of microsatellites located on the coding sequences (n=2 530) was less than that on the non-coding sequence such as introns (n=200 906) and intergenic regions (n=454 596)， and this was consistent with previous studies. This study provides adequate material for the future study of forest musk deer.

Moschusberezovskii； genome； microsatellite； distribution regularities

2017-02-17接受日期：2017-04-26

四川省科技支撐計(jì)劃(2014NZ0107)

盧婷(1991—)， 女， 碩士研究生， 從事動(dòng)物分子生物學(xué)研究， E-mail：619016141@qq.com#同等貢獻(xiàn)第一作者

*通信作者Corresponding author， E-mail：bsyue@scu.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20170044

Q959.8

： A

： 1000-7083(2017)04-0420-05