優(yōu)化易錯(cuò)PCR條件以提高畢赤酵母GAP啟動(dòng)子文庫(kù)突變效率

秦秀林錢江潮儲(chǔ)炬

（1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

優(yōu)化易錯(cuò)PCR條件以提高畢赤酵母GAP啟動(dòng)子文庫(kù)突變效率

秦秀林1錢江潮2儲(chǔ)炬2

（1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

高效的隨機(jī)突變策略對(duì)于構(gòu)建含有豐富突變體的啟動(dòng)子文庫(kù)至關(guān)重要。為了建立一個(gè)突變率適中并能獲得較多有益突變子的易錯(cuò)PCR（error-prone PCR，EP-PCR）條件，實(shí)現(xiàn)畢赤酵母GAP啟動(dòng)子的高效突變，對(duì)EP-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化?？疾炝四０鍧舛取⒎磻?yīng)循環(huán)數(shù)和Mg2+濃度對(duì)EP-PCR的產(chǎn)物得率和突變率的影響后，確定了適于GAP啟動(dòng)子突變的EP-PCR條件：模板濃度、反應(yīng)循環(huán)數(shù)和Mg2+濃度分別為1 ng/μL、25和10 mmol/L。優(yōu)化EP-PCR條件后，GAP啟動(dòng)子突變率為1.1%，連續(xù)進(jìn)行3輪EP-PCR后突變率可達(dá)到4.0%。利用優(yōu)化后EP-PCR對(duì)GAP啟動(dòng)子進(jìn)行隨機(jī)突變，篩選了250個(gè)突變子，獲得5個(gè)啟動(dòng)子強(qiáng)度高于野生型GAP啟動(dòng)子的突變體，有益突變達(dá)到了2%，可用于構(gòu)建GAP啟動(dòng)子文庫(kù)。

易錯(cuò)PCR 突變效率 隨機(jī)突變 畢赤酵母 GAP啟動(dòng)子

利用易錯(cuò)PCR（Error prone PCR，EP-PCR）或DNA改組（DNA shuffling）等基因突變技術(shù)對(duì)基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行改造構(gòu)建啟動(dòng)子文庫(kù)，并已在原核和真核微生物的代謝工程、功能基因組學(xué)和合成生物學(xué)中得到了成功應(yīng)用［1-3］。啟動(dòng)子文庫(kù)是不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子集合體，在構(gòu)建時(shí)，對(duì)天然啟動(dòng)子序列進(jìn)行突變，再?gòu)闹泻Y選出合適強(qiáng)度的多個(gè)突變啟動(dòng)子從而組成啟動(dòng)子文庫(kù)［4］。由于啟動(dòng)子的堿基序列直接影響其調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)度，故只要所構(gòu)建的文庫(kù)包含足夠豐富的突變序列，篩選量足夠大，就可以從中篩選出一系列具有不同調(diào)控強(qiáng)度的突變啟動(dòng)子，構(gòu)成能對(duì)其下游基因?qū)嵤┚_微調(diào)的文庫(kù)。

近年來(lái)，EP-PCR在啟動(dòng)子文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中應(yīng)用非常廣泛［5-7］。Alper等［4］通過(guò)EP-PCR獲得了噬菌體PL-λ啟動(dòng)子活性變化范圍較大的突變啟動(dòng)子文庫(kù)，啟動(dòng)子的活性在196倍的范圍內(nèi)變化，而報(bào)告基因gfp的轉(zhuǎn)錄分析證明突變啟動(dòng)子調(diào)控的轉(zhuǎn)錄水平可在 325倍的范圍內(nèi)變化，證明可通過(guò)隨機(jī)突變獲得啟動(dòng)子活性差別較大的突變體，以達(dá)到對(duì)基因進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)的目的。Nevoigt等［8］通過(guò)篩選EP-PCR突變的溶氧敏感型啟動(dòng)子DAN1突變體文庫(kù)，獲得了在微氧條件下也能夠誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子突變體，其啟動(dòng)子活性在微氧條件下是野生型啟動(dòng)子的1.8-2.9倍。Hartner等（Hartner et al. 2008）對(duì)巴斯德畢赤酵母強(qiáng)啟動(dòng)子AOX1的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列（TFBSs）進(jìn)行突變改造后，利用96孔深孔板進(jìn)行高通量篩選，挑選出的突變啟動(dòng)子的活性可在原AOX1啟動(dòng)子強(qiáng)度6%至160%之間變化。啟動(dòng)子文庫(kù)能實(shí)現(xiàn)目的基因表達(dá)的精確調(diào)控，但其不足之處是突變后獲得的有益突變體較少，Nevoigt等［8］在篩選了12 000個(gè)轉(zhuǎn)化子后只有6個(gè)突變體的啟動(dòng)子活性較野生型啟動(dòng)子提高；Alper等［4］在篩選過(guò)程中從30 000個(gè)菌落中只篩到不足0.1%具有有用啟動(dòng)子的菌株。因此，啟動(dòng)子文庫(kù)構(gòu)建的主要難點(diǎn)不是繁重的高通量篩選，而是建立一個(gè)能獲得較多有益突變的EP-PCR條件。

作為真核生物，畢赤酵母具有高等真核表達(dá)系統(tǒng)的許多優(yōu)點(diǎn)：如蛋白加工、折疊、翻譯后修飾等，并已成功用于異源蛋白和代謝物的表達(dá)。這些使得畢赤酵母廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。利用EP-PCR對(duì)畢赤酵母組成型三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子GAP進(jìn)行隨機(jī)突變，構(gòu)建GAP突變文庫(kù)可以為畢赤酵母基因的連續(xù)表達(dá)調(diào)控提供一新的基因操作平臺(tái)。EP-PCR的關(guān)鍵在于選擇適當(dāng)?shù)耐蛔冾l率，一般有益突變頻率較低，絕大多數(shù)突變是有害或中性。若突變頻率過(guò)高，幾乎無(wú)法篩選到有益突變；若突變頻率太低，則未發(fā)生任何突變的野生型在突變?nèi)后w中將占優(yōu)勢(shì)，也很難篩選到理想突變體；而目標(biāo)基因的突變率在1%-5%范圍時(shí)才能獲得較多的有益突變達(dá)到理想的誘變結(jié)果［9，10］。

因此，為了獲得大量的具有豐富突變的GAP啟動(dòng)子并增加啟動(dòng)子的突變效率，本研究對(duì)EP-PCR反應(yīng)條件：模板濃度、循環(huán)數(shù)和Mg2+濃度分別進(jìn)行優(yōu)化，并應(yīng)用優(yōu)化后條件對(duì)GAP啟動(dòng)子進(jìn)行突變。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保藏，畢赤酵母菌株GS115和pGAP Z載體購(gòu)自Invitrogen公司，克隆載體pMD18-T購(gòu)自TaKaRa公司。DNA序列經(jīng)TaKaRa公司測(cè)定。

1.1.2 試劑 脫氧核糖核苷酸（dATP、dTTP、dGTP和dCTP）、TaqDNA 聚合酶均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。限制性內(nèi)切酶和連接反應(yīng)試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品，質(zhì)粒小量抽提、膠回收試劑盒和PCR反應(yīng)液純化試劑盒為AxyGen公司產(chǎn)品。其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng) 大腸桿菌DH5α在LLB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒后LLB培養(yǎng)基需添加zeocin 至終濃度為25 μg/mL。畢赤酵母菌株在YPD培養(yǎng)基（1% yeast extract，2% peptone，2% glucose）、BMD培養(yǎng)基（1.34% YNB，1% glucose，4×10-5% biotin，100 mmol/L potassium phosphate，pH6）或 BMDY培養(yǎng)基（1% yeast extract，2% peptone，1.34% YNB，1%葡萄糖，4×10-5% biotin，100 mmol/L potassium phosphate，pH 6）中28℃培養(yǎng)。

1.2.2 畢赤酵母GS115的轉(zhuǎn)化 重組質(zhì)粒經(jīng)BspEI線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，用引物GAP primer和GFP-r（表1）經(jīng)菌落PCR確定重組基因整合的正確性。轉(zhuǎn)化子的篩選用含0.4 μg/mL biotin 的MD平板（1.34%YNB，2%葡萄糖，1.5%瓊脂粉）。

表1 引物列表

1.2.3 EP-PCR突變GAP啟動(dòng)子 以質(zhì)粒pGAP Z

為模板，用引物GAP-EPf /GAP-EPr（表1）經(jīng)EPPCR獲得突變的GAP啟動(dòng)子，EP-PCR反應(yīng)體系為100 μL，所含Mn2+、dATP、dGTP、dCTP、dTTP濃度固定不變分別為0.5、0.2、0.2、1和1 mmol/L。10×PCR緩沖液：100 mmol/L Tri-HCl（pH8.3），500 mmol/L KCl，20 mmol/L MgCl2。易錯(cuò)PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸1 min，25個(gè)循環(huán)。

1.2.4 GAP啟動(dòng)子突變文庫(kù)的篩選 GAP啟動(dòng)子突變文庫(kù)高通量篩選采用48深孔板，每孔裝900 μL培養(yǎng)基，于30℃，220 r/min培養(yǎng)。篩選方式參照之前報(bào)道的方法［11］：將轉(zhuǎn)化后的轉(zhuǎn)化子涂布于MD篩選平板，待單菌落直徑至3 mmol/L左右接種至保種板培養(yǎng)（Master plate）培養(yǎng)；取保種板24 h培養(yǎng)菌液至對(duì)應(yīng)的預(yù)培養(yǎng)板孔（preculture plate）中培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)板的48深孔板每孔裝900 μL的BMD（0.2%葡萄糖）；從預(yù)培養(yǎng)板取培養(yǎng)48 h的菌液至主培養(yǎng)板（Main culture plate）中對(duì)應(yīng)孔中，主培養(yǎng)板的48深孔板每孔裝900 μL的BMD（1%葡萄糖），培養(yǎng)36 h后取菌液測(cè)定菌體濃度和yEGFP表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.5 菌體密度測(cè)定 菌液稀釋一定倍數(shù)后在波長(zhǎng)600 nm處以無(wú)菌培養(yǎng)基為對(duì)照進(jìn)行比色，OD600=OD讀數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1.2.6 重組菌中yEGFP熒光強(qiáng)度檢測(cè) 將主培養(yǎng)板培養(yǎng)了36 h的菌液取30 μL至裝有220 μL PBS的96孔板中，利用多功能酶標(biāo)儀（（BioTek Synergy 2）檢測(cè)酵母增強(qiáng)型綠色熒光蛋白yEGFP熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)：395 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：509 nm）。檢測(cè)yEGFP熒光強(qiáng)度時(shí)，以不表達(dá)yEGFP的基因工程菌G/GH［11］作為對(duì)照去除背景干擾。比熒光強(qiáng)度F/OD600（RFU/ OD600）為熒光強(qiáng)度值比上對(duì)應(yīng)細(xì)胞密度OD600。

2 結(jié)果

2.1 EP-PCR反應(yīng)體系中模板濃度的優(yōu)化

為了提高目的基因的突變率并保證能獲得較多的擴(kuò)增產(chǎn)物，首先對(duì)EP-PCR反應(yīng)體系中模板（pGAP Z質(zhì)粒）濃度進(jìn)行了優(yōu)化。反應(yīng)體系中模板終濃度為0.1、0.5、1和2 ng/μL時(shí)EP-PCR獲得的產(chǎn)物（圖1）經(jīng)純化后利用NanoDrop分別測(cè)定其DNA的濃度。模板濃度為0.1 ng/μL和0.5 ng/μL時(shí)，EP-PCR產(chǎn)物濃度分別只達(dá)到25 ng/μL和40 ng/μL；當(dāng)模板濃度達(dá)到1 ng/μL時(shí)，EP-PCR產(chǎn)物濃度增加到85 ng/μL；增加模板濃度至2 ng/μL時(shí)，EP-PCR產(chǎn)物量沒(méi)有顯著提高（90 ng/μL）。因此，EP-PCR反應(yīng)體系中模板濃度為1 ng/μL時(shí)，可以獲得較多的產(chǎn)物。

圖1 反應(yīng)體系中模板濃度對(duì)EP-PCR的影響

2.2 EP-PCR反應(yīng)體系循環(huán)數(shù)的優(yōu)化

為了研究循環(huán)數(shù)對(duì)EP-PCR產(chǎn)物濃度的影響，將EP-PCR反應(yīng)體系中的循環(huán)數(shù)設(shè)為20、25、30和35（反應(yīng)體系中模板濃度為1 ng/μL），并利用NanoDrop檢測(cè)對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物濃度，結(jié)果如圖2。當(dāng)擴(kuò)增只進(jìn)行20個(gè)循環(huán)時(shí)，EP-PCR產(chǎn)物濃度約35 ng/μL；循環(huán)數(shù)增加至25時(shí)，產(chǎn)物濃度提高至約85 ng/μL；循環(huán)數(shù)增加至30和35時(shí)，產(chǎn)物濃度分別為83 ng/μL和88 ng/μL?？梢娺_(dá)到25個(gè)循環(huán)后，產(chǎn)物濃度達(dá)飽和，增加循環(huán)數(shù)，并不能提高產(chǎn)物的濃度。因此，EP-PCR反應(yīng)體系最佳的循環(huán)數(shù)為25。

圖2 循環(huán)數(shù)對(duì)EP-PCR的影響

2.3 EP-PCR反應(yīng)體系中Mg2+濃度的優(yōu)化

為了優(yōu)化易錯(cuò)PCR的反應(yīng)條件，達(dá)到所需要的突變率（1%-5%），將反應(yīng)體系的模板濃度和循環(huán)

數(shù)分別設(shè)為1 ng/μL和25，以不同的Mg2+濃度：4、6、8 、10、12 和15 mmol/L分別進(jìn)行了易錯(cuò)PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖3。Mg2+濃度在4 -10 mmol/L范圍內(nèi)可擴(kuò)增出單一的目的條帶且產(chǎn)物濃度均達(dá)到約90 ng/μL；當(dāng)Mg2+濃度為12 mmol/L時(shí)雖然擴(kuò)增出了目的條帶但也出現(xiàn)了較多的非特異性條帶；而Mg2+濃度增加至15 mmol/L時(shí)產(chǎn)物出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，沒(méi)有擴(kuò)增出特異性條帶。

圖3 Mg2+濃度對(duì)EP-PCR的影響

將各Mg2+濃度反應(yīng)產(chǎn)物克隆至載體pMD18-T并分別隨機(jī)挑選10個(gè)突變子測(cè)序以統(tǒng)計(jì)其突變率。結(jié)果如表2，Mg2+離子濃度為4 mmol/L時(shí)所產(chǎn)生的突變率較低只有0.6%，而Mg2+離子濃度為10 mmol/L時(shí)產(chǎn)生的突變率為1.1%。6 mmol/L和8 mmol/L的Mg2+濃度易錯(cuò)PCR反應(yīng)突變率分別為0.74%和0.83%。這些突變序列與野生型GAP啟動(dòng)子序列相比，突變堿基分布在整個(gè)啟動(dòng)子序列，無(wú)明顯規(guī)律。試驗(yàn)表明Mg2+離子濃度為10 mmol/L時(shí)產(chǎn)生的突變率較適中能滿足試驗(yàn)要求，因此，EP-PCR反應(yīng)體系的Mg2+離子濃度為10 mmol/L。

表2 不同反應(yīng)條件易錯(cuò)PCR的突變率

2.4 連續(xù)進(jìn)行多輪EP-PCR以提高突變率

為了增加EP-PCR的突變率，在第1輪EP-PCR的基礎(chǔ)上又進(jìn)行第2或第3輪的EP-PCR。試驗(yàn)中，EP-PCR反應(yīng)體系的Mg2+、Mn2+、dATP、dGTP、 dCTP、dTTP和模板濃度固定不變分別為10 mmol/L、0.5 mmol/L、0.2 mmol/L、0.2 mmol/L、1 mmol/L、1 mmol/L和1 ng/μL，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。第2和第3論EP-PCR的模板分別為第1輪EP-PCR和第2輪EP-PCR的回收產(chǎn)物，模板的添加量為1%（V/V），每輪隨機(jī)挑選10個(gè)突變體進(jìn)行克隆并測(cè)序。經(jīng)過(guò)3輪EP-PCR，突變率可達(dá)到1.1%-4.0%（表3）。變啟動(dòng)子的序列各不相同，突變堿基分布在整個(gè)啟動(dòng)子序列，無(wú)明顯規(guī)律。連續(xù)進(jìn)行3次EP-PCR突變率為4.0%，達(dá)到了預(yù)期的突變率，可用于GAP啟動(dòng)子的突變。

表3 經(jīng)過(guò)3輪易錯(cuò)PCR反應(yīng)后的突變率

2.5 應(yīng)用優(yōu)化后EP-PCR對(duì)GAP啟動(dòng)子進(jìn)行突變

為了檢測(cè)突變啟動(dòng)子強(qiáng)度，構(gòu)建了突變啟動(dòng)子調(diào)控報(bào)告基因（酵母增強(qiáng)型綠色熒光蛋白yEGFP基因egfp）表達(dá)載體及對(duì)應(yīng)重組菌，通過(guò)測(cè)定重組菌yEGFP熒光強(qiáng)度以檢測(cè)對(duì)應(yīng)的突變啟動(dòng)子強(qiáng)度。

首先以質(zhì)粒pGAP Z為模板，用引物GAPEPf/GAP-EPr（表1）經(jīng)EP-PCR獲得突變的GAP啟動(dòng)子，經(jīng)限制性內(nèi)切酶SpeI和NotI雙酶切，將突變的GAP啟動(dòng)子混合片段與經(jīng)SpeI和NotI雙酶切后載體pGHg［11］連接，獲得重組混合質(zhì)粒，將這些重組混合質(zhì)粒用限制性酶BspeI酶切線性化，電轉(zhuǎn)畢赤酵母GS115，獲得突變GAP啟動(dòng)子重組畢赤酵母細(xì)胞庫(kù)。轉(zhuǎn)化后涂布MD平板，30℃倒置培養(yǎng)3-5 d，直到單克隆出現(xiàn)。隨機(jī)挑選30個(gè)克隆，采用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，PCR所用引物分別為GAP primer和GFP-r（表1），陽(yáng)性克隆PCR條帶理論大小約800 bp。圖4的結(jié)果表明，畢赤酵母GAP突變啟動(dòng)子細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建成功。

利用48深孔板，通過(guò)高通量篩選方法［11］篩選所構(gòu)建的突變體，并用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)重組菌的yEGFP熒光強(qiáng)度。隨機(jī)挑取了250個(gè)突變子進(jìn)行篩選，檢測(cè)到熒光強(qiáng)度較重組菌G/GHg（野生型GAP啟動(dòng)子調(diào)控yEGFP表達(dá)菌株）顯著提高的重組菌

（G/GaHg、G/GbHg、G/GcHg、G/GdHg和G/GeHg）5個(gè)，其熒光強(qiáng)度值見表4。為了驗(yàn)證這些重組菌的yEGFP熒光強(qiáng)度改變確實(shí)是由于啟動(dòng)子序列突變引起，將突變GAP啟動(dòng)子序列克隆并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明重組菌中對(duì)應(yīng)的突變啟動(dòng)子Ga、Gb、Gc、Gd和Ge的序列各不相同（圖5），與野生型GAP啟動(dòng)子序列相比，突變堿基分布在整個(gè)啟動(dòng)子序列，無(wú)明顯規(guī)律。這一結(jié)果表明重組菌中的啟動(dòng)子序列確實(shí)發(fā)生了突變，重組菌yEGFP表達(dá)強(qiáng)度不同也確實(shí)是由啟動(dòng)子的突變引起，利用優(yōu)化條件后EP-PCR能高效篩選到有益突變子（啟動(dòng)子強(qiáng)度增強(qiáng)）。

圖4 畢赤酵母GAP突變啟動(dòng)子重組菌菌落PCR驗(yàn)證

表4 含突變啟動(dòng)子重組菌的綠色蛋白熒光強(qiáng)度

3 討論

EP-PCR是一種簡(jiǎn)便快速地在DNA序列中隨機(jī)制造突變的方法，而且EP-PCR方法對(duì)目的基因沒(méi)有片段大小的限制，并且因?yàn)樾蛄芯哂袔缀?00%的均一性，所以得到的克隆在遺傳學(xué)上比較穩(wěn)定。與傳統(tǒng)的隨機(jī)突變中常用的亞硝基胍相比，EP-PCR突變獲得的突變文庫(kù)，其性狀的多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于致死率為40%-50%時(shí)亞硝基胍的突變效果［12］。然而利用EP-PCR進(jìn)行隨機(jī)突變，一般1 kb目標(biāo)基因內(nèi)只有1.5-6.6個(gè)堿基發(fā)生堿基替換（突變率：0.15%-0.66%）［13，14］，而目標(biāo)基因的突變率在1%-5%范圍時(shí)才能獲得較多的有益突變以達(dá)到理想的誘變結(jié)果［9，10］。因此，為了獲得大量的具有豐富突變的啟動(dòng)子并增加啟動(dòng)子的突變效率（1%-5%范圍）必須對(duì)EP-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。常規(guī)方式是通過(guò)改變傳統(tǒng)PCR反應(yīng)體系中某些組分的濃度，如模板、dNTP（不同的脫氧核糖核酸配比濃度）［15］、Mn2+［16］和Mg2+的濃度，使堿基在一定程度上隨機(jī)錯(cuò)誤而創(chuàng)造序列的多樣性。其中，Mn2+濃度通常為0.5 mmol/L，而為了避免堿基突變的偏向性dATP∶dGTP∶dCTP∶dTTP的比例通常設(shè)為1∶1∶5∶5［17］。因此，本研究中將EP-PCR反應(yīng)體系的Mn2+、dATP、dGTP、dCTP、dTTP濃度固定不變分別設(shè)為0.5、0.2、0.2、1和1 mmol/L，在此條件下，研究了EP-PCR反應(yīng)中模板濃度、循環(huán)數(shù)和Mg2+濃度對(duì)其影響。

EP-PCR反應(yīng)體系中模板的初始濃度會(huì)影響基因的突變效率和擴(kuò)增產(chǎn)物的量。反應(yīng)體系中模板的初始濃度越低，模板所經(jīng)歷的擴(kuò)增次數(shù)越多，最后產(chǎn)物中積累的突變位點(diǎn)越多，即突變效率越高［18］；而提高反應(yīng)體系中模板的初始濃度，突變效率會(huì)降低［19］但最終擴(kuò)增到的產(chǎn)物量會(huì)增加。本研究?jī)?yōu)化EP-PCR反應(yīng)體系中模板濃度（1 ng/μL）后，在獲得較多產(chǎn)物同時(shí)保證了目的基因較高的突變率。

在優(yōu)化EP-PCR反應(yīng)體系循環(huán)數(shù)的過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)25個(gè)循環(huán)得到的產(chǎn)物濃度可達(dá)到約85 ng/μL，再增加循環(huán)數(shù)，產(chǎn)物的濃度并沒(méi)有增加。這是因?yàn)樵谝欢ū对龃螖?shù)范圍內(nèi)，EP-PCR反應(yīng)過(guò)程中目的基因倍增次數(shù)與突變效率相關(guān)，即目的基因倍增次數(shù)越高產(chǎn)生的突變位點(diǎn)越多，同時(shí)形成的目的產(chǎn)物濃度也越高；但擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到一定濃度后（5-50 ng/μL）［20］，增加循環(huán)數(shù)并不能提高產(chǎn)生的量。

很多研究顯示，易錯(cuò)PCR的突變率受Taq酶保真性的影響。加入Mn2+后，Taq酶保真性隨著反應(yīng)體系中Mg2+的濃度增加而降低。為了增加EP-PCR的突變率，可以在第1輪EP-PCR的基礎(chǔ)上又進(jìn)行

第2或第3輪的EP-PCR［21］。EP-PCR反應(yīng)體系的Mg2+離子濃度達(dá)到10 mmol/L時(shí)GAP啟動(dòng)子產(chǎn)生的突變率達(dá)到了1.1%，經(jīng)過(guò)3輪連續(xù)EP-PCR，GAP啟動(dòng)子突變率的范圍為1.1%-4.0%，符合產(chǎn)生有益突變較多突變率范圍（1%-5%）。利用優(yōu)化后EPPCR對(duì)GAP啟動(dòng)子進(jìn)行突變，通過(guò)高通量篩選250個(gè)突變子，獲得5個(gè)啟動(dòng)子強(qiáng)度高于野生型GAP啟動(dòng)子的突變體，有益突變達(dá)到了2%。

圖5 突變GAP啟動(dòng)子序列比對(duì)

4 結(jié)論

本研究對(duì)EP-PCR反應(yīng)中模板濃度、循環(huán)數(shù)和Mg2+濃度分別進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化條件后，經(jīng)過(guò)3輪EP-PCR，突變率可達(dá)到1.1%-4.0%。利用優(yōu)化后的EP-PCR反應(yīng)條件對(duì)GAP啟動(dòng)子進(jìn)行突變，篩選了250個(gè)突變子，可挑選出啟動(dòng)子強(qiáng)度較野生型GAP啟動(dòng)子顯著提高的突變子5個(gè)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

High-error-rate Random Mutagenesis of GAP Promoter in Pichia pastoris Using an Optimited Error Prone PCR

Qin Xiulin1Qian Jiangchao2Chu Ju2
（1. College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530004；2. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science & Technology，Shanghai 200237）

The first important step toward a successful preparation of large and diverse promoter library with desired complexity, is to select a suitable mutagenesis strategy. To generate a promoter library of GAP promoter（pGAP）variants, mutations were introduced using error-prone PCR. After optimization of the conditions for EP-PCR random mutagenes, high mutation（error rate 1.1%）frequence was obtained using 1 ng/μL template and 10 mmol/L Mg2+, in combination with 25 thermal cycles. To increase mutational diversity and reach an appropriate error rate, three consecutive rounds of EP-PCR were carried out under the same conditions. After random sequencing of 10 clones from each round, an overall range of mutation rates from 1.1% to 4.0% was observed. Then, 250 clones containing pGAP variants were screened using the highthroughput screening approach in 48-deep-well plates. Among them, 5 mutants exhibited higher fluorescent intensity compared to the wildtype promoter.

Error-prone PCR Mutation frequency Random mutagenesis Pichia pastoris GAP promoter

2014-02-22

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013GXNSFBA019096）

秦秀林，女，講師，博士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：xiulinqin@gxu.edu.cn

錢江潮，女，教授，博士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：jiangchaoqian@ecust.edu.cn