董世訪 李桂清 江偉凡 楊 菲 曹朝暉 許桂蓮

(第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部免疫學(xué)教研室，重慶 400038)

1 型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus，T1DM)是一種以慢性炎癥和胰島β 細(xì)胞破壞為特征的自身免疫疾病［1］。T1DM 的發(fā)病常見于兒童或青少年，嚴(yán)重的并發(fā)癥是導(dǎo)致兒童早期死亡的主要因素。T1DM 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，胰島β 細(xì)胞死亡主要由細(xì)胞凋亡引起［2-4］。引起β 細(xì)胞凋亡的因素較多，其中自身反應(yīng)性T 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞入侵胰島是主要的誘因。目前較多學(xué)者認(rèn)為浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞釋放的促炎癥細(xì)胞因子如γ-干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子α (Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)連同F(xiàn)as 配體(FasL)、穿孔素和顆粒酶B 是導(dǎo)致β 細(xì)胞凋亡、早期胰島炎的形成及T1DM 發(fā)展的主要因素。而且，各種炎癥細(xì)胞因子是通過聯(lián)合而不是單獨(dú)作用誘導(dǎo)了β 細(xì)胞凋亡，炎癥細(xì)胞因子的組合方式和分布因動(dòng)物模型而異［5-7］。因此，更加明確地了解胰島β 細(xì)胞中不同細(xì)胞因子組合激活的凋亡信號(hào)通路，對(duì)于防治T1DM 實(shí)施個(gè)性化診療策略是十分必要的。

細(xì)胞凋亡信號(hào)通路主要包括死亡受體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和內(nèi)在的線粒體通路。已有研究表明凋亡的線粒體通路參與了IFN-γ 和TNF-α 聯(lián)合誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡［8-10］，但死亡受體途徑是否在β 細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用仍存在爭(zhēng)議;死亡受體途徑涉及IFN-γ 和TNF-α 誘導(dǎo)的NIT-1 細(xì)胞凋亡的文獻(xiàn)報(bào)道較少。因此，本研究以小鼠胰島β 細(xì)胞株NIT-1 為細(xì)胞模型，觀察IFN-γ 和TNF-α 聯(lián)合作用對(duì)NIT-1細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步研究了導(dǎo)致NIT-1 細(xì)胞凋亡的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 小鼠胰島β 細(xì)胞株NIT-1細(xì)胞購(gòu)自上海漢博生物科技有限公司;rmIFN-γ 和rmTNF-α 購(gòu)自美國(guó)Peprotech 公司;DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司;胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司;Hoechst33258、MTT、DMSO 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;兔抗小鼠Caspase-3、cleaved Caspase-3 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司;兔抗鼠Caspase-8、多聚ADP-核糖聚合酶［poly(ADP-ribose)polymerase，PARP］單克隆抗體、β-actin 多克隆抗體、ECL 試劑盒購(gòu)自碧云天公司;其余均為國(guó)產(chǎn)試劑(分析純級(jí))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) NIT-1 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、95%飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT 分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以2 ×104個(gè)/孔密度接種于96 孔板，用IFN-γ 和TNF-α 單獨(dú)或聯(lián)合處理NIT-1 細(xì)胞24、48 和72 h。其中未加IFN-γ 和TNF-α 刺激的細(xì)胞(即0 h)為空白對(duì)照組。細(xì)胞因子處理后，每孔加20 μl MTT(5 g/L)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后，棄培養(yǎng)基，每孔加150 μl DMSO，待紫色結(jié)晶完全溶解后，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm 的吸光度值。設(shè)定未處理組(即0 h)細(xì)胞生長(zhǎng)活力為100%，處理組細(xì)胞生長(zhǎng)活力(%)=處理組吸光度值/未處理組吸光度值×100%。

1.4 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析 細(xì)胞(1 ×104/孔)接種于96 孔板，IFN-γ 和TNF-α 聯(lián)合刺激細(xì)胞24、48 和72 h，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。另一組實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞(3 × 105/孔)接種于6 孔板的蓋玻片上，IFN-γ 和TNF-α 聯(lián)合刺激細(xì)胞48 h。其中未加IFNγ 和TNF-α 刺激的細(xì)胞(即0 h)為空白對(duì)照組。收獲細(xì)胞，PBS 洗3 遍后，用5 μg/ml Hoechst 33258 于室溫下避光染色15 min。激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。

1.5 Western blot 細(xì)胞(3 ×105/孔)接種6 孔板，IFN-γ 和TNF-α 聯(lián)合處理細(xì)胞12 h 和24 h。其中未加IFN-γ 和TNF-α 刺激的細(xì)胞(即0 h)為空白對(duì)照組。收獲細(xì)胞，預(yù)冷PBS 洗2 遍后，用細(xì)胞裂解液(150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，1 % Triton X-100，1% 脫氧膽酸鈉，0.1 %SDS)在4℃下裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，用Nano-Drop ND-1000 微型分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。每組蛋白樣品取35 μg 進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離，采用電轉(zhuǎn)移中的濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，用含5%脫脂牛奶的封閉液封閉2 h，用一定比例稀釋的 Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-8、PARP 和β-actin 一抗室溫孵育2 h 或4℃孵育過夜，再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育0.5～1 h，ECL 顯色，膠片顯影。以β-actin 為參照分析目的蛋白的相對(duì)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s 表示，統(tǒng)計(jì)方法采用方差齊性分析和非配對(duì)的t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α 聯(lián)合IFN-γ 抑制NIT-1 細(xì)胞的生長(zhǎng) MTT 結(jié)果表明，TNF-α 和IFN-γ 單獨(dú)處理NIT-1 細(xì)胞48 h 和72 h，產(chǎn)生輕微的毒性作用，但兩者結(jié)合顯著地降低了細(xì)胞活力，且具有時(shí)間依賴性(表1)。

2.2 TNF-α 聯(lián)合IFN-γ 對(duì)NIT-1 細(xì)胞形態(tài)的影響 倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，隨著TNF-α 和IFN-γ 聯(lián)合作用時(shí)間的延長(zhǎng)，NIT-1 細(xì)胞形態(tài)逐漸由不規(guī)則瓦片狀，開始變圓甚至漂浮，細(xì)胞密度明顯降低，細(xì)胞之間空隙增加(圖1)。Hoechst 33258 染色細(xì)胞核結(jié)果表明，未處理組細(xì)胞核染色質(zhì)分布均勻、呈正常的低密度藍(lán)染;而IFN-γ 和TNF-α 聯(lián)合處理組細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體、核固縮、呈致密濃染(圖2)。

2.3 TNF-α 聯(lián) 合IFN-γ 處 理NIT-1 細(xì) 胞，誘 導(dǎo)Caspase-3，-8 的活化 Caspases 家族是細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行凋亡程序的一類關(guān)鍵蛋白。如圖3 所示，TNF-α 和IFNγ 聯(lián)合處理細(xì)胞12 h 后，Caspase-3，-8 均出現(xiàn)明顯的裂解片段，表明此二者在細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下被激活。

2.4 PARP 的裂解 DNA 修復(fù)酶PARP 是Caspase-3 的一種作用底物蛋白，在細(xì)胞因子TNF-α 和IFNγ 的聯(lián)合作用下被裂解失活(見圖4)。

表1 TNF-α 聯(lián)合IFN-γ 對(duì)NIT-1 細(xì)胞生長(zhǎng)活力的影響(±s，n=4)Tab.1 Effect of TNF-α combined with IFN-γ on viability of NIT-1 cells (±s，n=4)

表1 TNF-α 聯(lián)合IFN-γ 對(duì)NIT-1 細(xì)胞生長(zhǎng)活力的影響(±s，n=4)Tab.1 Effect of TNF-α combined with IFN-γ on viability of NIT-1 cells (±s，n=4)

Note:1)P ＜0.01 compared with TNF-α group，2)P ＜0.01 compared with IFN-γ group.

圖1 TNF-α 聯(lián)合IFN-γ 對(duì)NIT-1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響Fig.1 Effect of TNF-α and IFN-γ on morphological changes of NIT-1 cells (×200)

圖2 TNF-α 聯(lián)合IFN-γ 對(duì)NIT-1 細(xì)胞核形態(tài)的影響Fig.2 Effect of TNF-α and IFN-γ on nuclear changes of NIT-1 cells

圖3 TNF-α 聯(lián)合IFN-γ 對(duì)NIT-1 細(xì)胞Caspase-3，-8 活化的影響Fig.3 Effect of TNF-α and IFN-γ treatment on activation of Caspase-3，-8 in NIT-1 cells

圖4 TNF-α 聯(lián)合IFN-γ 對(duì)NIT-1 細(xì)胞PARP 活性的影響Fig.4 Effect of TNF-α and IFN-γ on activation of PARP in NIT-1 cells

3 討論

T1DM 胰島炎的發(fā)展過程中，不同人群炎癥細(xì)胞因子的種類及它們之間的相互作用可能發(fā)生變化。細(xì)胞因子TNF-α 結(jié)合IFN-γ 誘導(dǎo)β 細(xì)胞死亡的確切分子機(jī)制還不是很清楚［5］。全面了解不同細(xì)胞因子組合在不同細(xì)胞模型中誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑，將有利于尋找個(gè)性化的藥物靶標(biāo)并為未來開展個(gè)性化治療提供理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)以小鼠胰島β 細(xì)胞株NIT-1 細(xì)胞為模型，體外研究IFN-γ 和TNF-α 協(xié)同作用誘導(dǎo)β 細(xì)胞凋亡及相關(guān)的信號(hào)途徑。MTT 結(jié)果顯示，TNF-α 和IFN-γ 聯(lián)合作用能顯著抑制NIT-1 細(xì)胞活力，且呈時(shí)間依賴性，而TNF-α、IFN-γ 單獨(dú)處理對(duì)細(xì)胞僅產(chǎn)生輕微的毒性作用(表1)。隨著TNF-α 和IFN-γ 作用于細(xì)胞的時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞變圓甚至漂浮，細(xì)胞密度明顯降低，細(xì)胞間隙增加(圖1)，細(xì)胞核出現(xiàn)凋亡小體、核固縮、呈致密濃染(圖2)。提示IFN-γ 和TNF-α 對(duì)NIT-1 細(xì)胞的毒性作用是由于細(xì)胞凋亡所致，以上結(jié)果與Suk 等［11］在MIN6 細(xì)胞中觀察的結(jié)果一致。IFN-γ 和TNF-α 引起NIT-1 細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制是否涉及細(xì)胞凋亡的死亡受體途徑?未見報(bào)道。

凋亡是一種自主的程序性細(xì)胞死亡形式，Caspases 家族蛋白在凋亡過程中起著關(guān)鍵作用［12-14］。信號(hào)傳遞激活外在的死亡受體途徑，即經(jīng)死亡受體相關(guān)的包含死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas-Associated Death Domain-Containing Protein，F(xiàn)ADD)信號(hào)傳遞激活Caspase-8。Caspase-3 是Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)中一種共同的下游效應(yīng)分子，是凋亡的執(zhí)行者。Caspase-8 通過裂解Caspase-3 的無活性酶原形式而激活Caspase-3。Caspase-3 再裂解細(xì)胞內(nèi)其他蛋白底物如PARP，PARP 是DNA 修復(fù)酶，它被裂解后失去正常功能，激活受PARP 負(fù)調(diào)控的核酸內(nèi)切酶活性，最終導(dǎo)致核小體DNA 斷裂，從而觸發(fā)細(xì)胞凋亡程序［15-17］。

本研究中，IFN-γ 和TNF-α 聯(lián)合作用于小鼠胰島β 細(xì)胞株NIT-1 細(xì)胞不同的時(shí)間后，提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行Western blot 分析。結(jié)果顯示，隨著作用時(shí)間的增加，細(xì)胞內(nèi)Caspase-8 和Caspase-3 相繼被裂解激活(圖3)，引起了下游分子PARP 的裂解(圖4)。我們的研究結(jié)果證實(shí)，IFN-γ 和TNF-α 聯(lián)合處理誘導(dǎo)了NIT-1 細(xì)胞凋亡與其激活死亡受體進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。至于是否還涉及其他相關(guān)凋亡途徑，還有待進(jìn)一步研究。Fas 或Fas 相關(guān)的包含死亡結(jié)構(gòu)域的蛋白可能作為藥物靶點(diǎn)在防治T1DM 方面發(fā)揮一定作用。

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