周立斌 白 茹 馬細蘭 王樹齊 張海發(fā)

(1. 惠州學院生命科學系 生物技術研究所 惠州 516007; 2. 華南師范大學生命科學學院 廣州 510631;3. 汕頭大學 廣東省海洋生物技術重點實驗室 汕頭 515063; 4. 廣東省海洋漁業(yè)試驗中心 惠州 516081)

一氧化氮(nitric oxide, 簡稱NO)是一種氣體信號分子, 許多研究表明, NO對魚類的非特異性免疫有著重要的作用, 通過格蘭氏陽性菌(Renibacterium salmoninarum)處理虹鱒后, 發(fā)現(xiàn)血清中一氧化氮含量升高, 并且魚體血清中一氧化氮含量隨細菌毒性增強而增高(Campos-Perezet al, 2000)。用一種熱滅活乳酸菌的(Lactococcus lactis)能顯著誘導巨噬細胞產生NO (Villamilet al, 2002)。水產動物體內的NO在病毒免疫方面也有一定的作用, 病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)能導致大菱鲆體內的NO含量增加(Tafallaet al, 1999)。NO的生成通過一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, 簡稱NOS)進行, 通過催化L-精氨酸, 在體內合成NO, 從而在魚體的免疫中起到作用。一氧化氮合酶(NOS)參與魚類的多種生理活動并與免疫和神經傳遞有關, 有研究表明病毒性出血性敗血癥病毒促使虹鱒體內的誘導型一氧化氮合酶含量增加的上調(Tafallaet al, 2005)。

美國紅魚(Sciaenops ocellatusLinnaeus), 屬鱸形目Perciformes、石首魚科Scuaebudae、擬石首魚屬Sciaenops, 是一種重要的養(yǎng)殖魚類。有關美國紅魚生長和免疫的研究有一些報道(周立斌等, 2009, 2013),主要是研究維生素和礦物質對美國紅魚生長和免疫的影響, 但有關美國紅魚的一氧化氮免疫調控的研究相對較少(Zhouet al, 2009; 周立斌等, 2012)。本實驗研究在配合飼料中添加不同劑量的維生素C對美國紅魚組織中的NO含量、NOS活力以及nNOS基因mRNA的表達的影響, 探討維生素C與美國紅魚組織中NO、NOS以及nNOS基因的免疫關系, 對美國紅魚飼料飼料配方設計和魚病防治提供基礎資料和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗魚與試驗設計

試驗于廣東省海洋漁業(yè)試驗中心進行, 試驗魚和試驗設計參考周立斌等(2013)方法, 美國紅魚分6組, 各組維生素C實際含量為0、49.3、98.9、198.7、398.6、1987.4 mg/kg, 分別用C0、C49.3、C98.9、C197.5、C396.4和C1989.8來表示。

1.2 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)管理參考周立斌等(2013)方法。試驗共進行8周, 將美國紅魚解剖后取出出頭腎、脾臟、肝臟、腸、腦、胸腺組織, 存放于–80°C低溫冰箱備用。

1.3 試劑

總RNA提取試劑Trizol Reagent試劑盒購自Invitrogen公司。 ReVerTra Ace-a-TMKit、Real-time PCR Master Mix試劑盒購自TOYOBO公司Ex-TaqPolymerase Kit購自TaKaRa公司。引物委托上海英俊生物工程公司合成。100bp DNA Ladder為天為時代公司產品; 其余均為國產分析純試劑。

1.4 美國紅魚組織nNOS基因表達分析

選取頭腎、脾臟、肝臟、腸、腦、胸腺組織進行檢測。用Trizol提取各組織的總RNA, 通過DnaseⅠ處理后。采用ReVerTra Ace-a-TMKit進行反轉錄。根據(jù)已測序的美國紅魚nNOS基因cDNA序列和18S基因序列, 應用Prime Primer 5.0引物設計軟件在美國紅魚nNOS基因3’端設計適用于Real-time PCR的引物(表1)。引物委托上海英俊生物工程公司合成。

Real-time PCR反應體系采用20μL體系: 10μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix, 1μL RT產物,0.4μL特異性產物。PCR反應程序為: 95°C預變性60s; 隨后95°C變性15s, 57°C退火15s, 72°C延伸30s,進行40個循環(huán)。

通過ABI PRISM 7900 Sequence Detection System(Applied Biosystems)測定, 達到熒光閾值(CT)的18S反應循環(huán)數(shù)。通過質粒濃度和所對應CT值建立β-action、nNOS基因的標準曲線。然后通過各樣本達到CT值所需的循環(huán)數(shù), 和相應的內參基因達到CT值所對應的循環(huán)數(shù)做比對, 從而得出樣本的相對濃度,結果采用相對濃度表示, 即表示為目的基因濃度/內參基因濃度(nNOS/β-action×100)。

表1 Real-time PCR檢測美國紅魚體內nNOS基因所用引物Tab.1 Nucleotide sequences of the primers used for Real-time PCR

1.5 NO和NOS測定

NO測定采用硝酸還原酶法, NOS測定采用化學比色法, 試劑均購于南京建成生物工程研究所。各項指標的測定均在722紫外光柵分光光度計上進行。

1.6 數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計

實驗所得數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤(mean±SE),采用SPSS11.0軟件統(tǒng)計包中的單因素方差分析和Duncan’s法檢驗, 當P＜0.05時認為差異顯著。

2 結果

2.1 飼料維生素C對美國紅魚組織NO含量的影響

經過8周飼養(yǎng)試驗, 各試驗組美國紅魚各組織NO含量見表2。從表2可以看出, 頭腎、肝、腸、胸腺NO含量隨著飼料維生素C含量增加有顯著增加,飼料中維生素C最高含量的C1989.8組頭腎、肝、腸和胸腺中NO含量與其它試驗組NO含量相比有顯著增加, 達到最高水平; 脾中各組NO含量無顯著性差異;腦中NO含量對照組C0組與其它各組相比有顯著性差異, 其它各組之間腦中NO含量無顯著性差異。

表2 不同水平飼料維生素C處理對美國紅魚組織NO(μmol/g prot)的影響Tab.2 Effect of dietary vitamin C in different level on NO in tissues of red drum

2.2 飼料維生素C對美國紅魚組織NOS活力的影響

經過8周飼養(yǎng)試驗, 各試驗組美國紅魚各組織NOS活力見表3。從表3可以看出, 頭腎、肝、胸腺NOS活力隨著飼料維生素C含量增加有顯著增加, 飼料中維生素C最高含量的C1989.8組頭腎、肝和胸腺中NO含量與其它試驗組NO含量相比有顯著增加, 達到最高水平; 脾和腸中各組NOS活力無顯著性差異; 腦中NOS活力C396.4組與其它各組相比有顯著性差異,其它各組腦中NOS活力沒有顯著性的差異。

2.3 飼料維生素C對美國紅魚組織nNOS基因mRNA表達的影響

經過8周飼養(yǎng)試驗, 各試驗組美國紅魚各組織nNOS基因mRNA表達的結果見表4。從表4可以看出, 腦中各組nNOS基因mRNA的表達含量無顯著性差異; 頭腎、脾、肝、腸和胸腺的各組nNOS基因mRNA的表達含量有顯著性差異, 變化趨勢不明顯,在飼料維生素C含量達到最高水平1989.8mg/kg時,各組織內的nNOS基因mRNA的表達量最高。

表3 不同水平飼料維生素C處理對美國紅魚NOS活力(U/mg prot)的影響Tab.3 Effect of dietary vitamin C in different level on NOS activity in tissues of red drum

表4 不同水平飼料維生素C處理對美國紅魚組織nNOS基因mRNA表達(1×10-8 nNOS/18S)的影響Tab.4 Effect of dietary vitamin C in different level on nNOS mRNA expression in tissues of red drum

3 討論

大量的實驗證據(jù)表明, NO 參與心血管系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和腫瘤等多種生理活動的調節(jié)(Moncadaet al, 1991)。有關哺乳動物的研究中, NO在舒張血管的反應中具有重要作用,可以維持正常血管的張力。NOS在中樞神經系統(tǒng)(CNS)中分布非常廣泛, 通過免疫組化技術, 已在大鼠小腦、上下丘、海馬齒狀回、垂體后葉、下丘腦視上核、室旁核等處發(fā)現(xiàn)有強陽性免疫反應產物(Saxenaet al, 2001)。NO在CNS的信號傳遞中起神經遞質的作用。NO在免疫系統(tǒng)中有重要的功能, 包括抗菌, 抗腫瘤, 抗炎癥, 促進細胞因子、趨化因子、生長因子增殖, 促進T細胞活化等各方面的功能(Kolbet al, 1998;Kronckeet al, 1998; Weinberg, 1998)。

神經元型NOS (neuronal NOS, nNOS) 為細胞內鈣離子依賴型, 在正常生理狀態(tài)下即可表達, 產生少量NO發(fā)揮生理效應。nNOS在哺乳動物中的許多組織中都有分布, 而在魚類中, 虹鱒魚仔魚頭腎中的nNOS細胞數(shù)量較多, 隨著魚體長大, nNOS細胞出現(xiàn)在一些神經細胞和神經纖維中(Campos-Perezet al,2000), 虹鱒成魚腎和胃腸道中NOS細胞數(shù)目也較多(Joneset al, 2007)。而NOS合酶的基因在海膽、果蠅、蚊、魚、雞、鼠、牛和人中都進行了研究。人類nNOS基因是三個亞型基因中最大的, 長度大于24kb, 含29個外顯子(Chartrainet al, 1994)。目前在多種魚中已有NOS基因研究的報道, 包括虹鱒、金魚、大西洋鮭和溝鯰等(Bellet al, 1997; Lainget al, 1999;Ebbessonet al, 2005)。

維生素C是魚類生長和生理活動必需的營養(yǎng)物質, 有研究表明它在魚類的免疫中有著重要的作用。維生素C在體內參與氧化還原反應, 作為脯氨酸羥化酶的輔酶直接影響膠原蛋白的合成。鲇魚飼料中缺乏維生素C會導致生長變慢, 脊柱變形, 出血, 鰭壞死等嚴重癥狀(Limet al, 1978)。維生素C還具有防止低價鐵的氧化, 促進腸道對鐵的吸收, 增強水生動物的抗病力等生理功能(趙文, 1995)。研究表明, 配合餌料中添加維生素C可以增強中國對蝦的抗低氧能力, 同時降低中國對蝦的發(fā)病率(王安利等, 1996)。金頭鯛(Sparus aurataL.)頭腎巨噬細胞與含維生素C的培養(yǎng)液孵育能提高其細胞殺傷活性, 體內實驗也表明, 飼料中添加維生素C能提高其血清溶菌酶活力(Cuestaet al, 2008)。本研究中, 飼料中最高含量的維生素C的組頭腎、肝、腸和胸腺中NO含量與其它試驗組NO含量相比有顯著增加, 表明隨著飼料中維生素C水平增加, 頭腎、肝、腸和胸腺中NO含量也隨著增加; 脾中各組NO含量無顯著性差異, 表明飼料中維生素C含量對脾組織中NO含量影響不大; 另外各試驗組腦中NO含量與對照組相比有顯著增加, 表明飼料中添加維生素C能顯著影響美國紅魚腦中NO含量。Montero等(1999)的研究也表明, 金頭鯛(Sparus aurataL.)攝食維生素C含量為250mg/kg的飼料時,耐密集和抗病力較強; 而攝食含500—300mg維生素C的飼料時, 頭腎白細胞的吞噬活性、呼吸暴發(fā)活力較強(Muleroet al, 1998; Ortunoet al, 2001); 維生素C對美國紅魚組織中NOS活力的影響的結果類似于組織中NO含量的變化。本研究中, 頭腎、肝、胸腺NOS活力隨著飼料維生素C含量增加有顯著增加, 與組織中NO含量的變化相類似; 腦中NOS活力C396.4組與其它各組相比有顯著性差異, 表明飼料中適當?shù)木S生素C可以提高腦中NOS活力, 維生素C含量過高可能影響腦中NOS活力。另外本研究中, 脾和腸中各組NOS活力無顯著性差異, 表明維生素C對美國紅魚脾和腸組織中NOS活力影響不大。

對于NOS基因表達與免疫的研究, 大多集中在誘導型NOS(iNOS)基因的誘導表達, 有關nNOS基因誘導表達研究在魚類開展的還很少, 通過本次實驗,可以推測美國紅魚體內的nNOS的表達像iNOS一樣,也是可以被誘導表達的。與iNOS表達誘導不同的是,nNOS基因在正常的生理狀態(tài)下少量的表達, 產生少量的NO維持機體的生理活動。在本研究中, 高劑量的維生素C對美國紅魚nNOS基因mRNA的表達起到明顯的促進作用, 除在脾臟外, 其它組織內的nNOS基因mRNA的表達均隨著維生素C的濃度的增長有所增高, 并且維生素C含量在1987.4mg/kg時對多數(shù)組織nNOS基因表達的促進作用最為顯著, 這與包膜維生素C對胡子鯰血清SOD活力的結果類似(李桂峰等, 2004), 隨著飼喂時間的增長和維生素C水平的增加, 其SOD活力就越高, 以血清SOD為非特異性免疫指標, 大口黑鱸飼料中維生素C最適添加量為2000 mg/kg。還有報道, 當維生素C濃度為3g/kg添加飼料投喂金頭鯛(Sparus aurataL.), 發(fā)現(xiàn)其體內頭腎巨噬細胞吞噬能力和呼吸鏈暴發(fā)活性增強(Ortunoet al, 2001), 通過本次研究可以推測維生素C不僅可以增強機體溶菌酶、SOD以及巨噬細胞吞噬能力, 還能夠誘導體內nNOS的表達, 從而進一步增強機體免疫能力。更重要的是, 通過實驗發(fā)現(xiàn)維生素C對胸腺和頭腎內nNOS基因mRNA基因表達促進作用量明顯高于其它組織內nNOS基因的表達, 這又進一步證明維生素C可以在機體免疫方面起到重要的作用。綜上所述, 飼料中添加適當維生素C對美國紅魚組織中的NO含量、NOS活力和nNOSmRNA基因表達有顯著影響, 表明飼料中適當?shù)木S生素C對美國紅魚的免疫有促進作用。

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