徐翠蓮 張 丹 田依軒 張俐敏 王瑞清

(塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院， 新疆 阿拉爾 843300)

花粉活力是生物學(xué)研究的重要內(nèi)容，其活力大小可估測(cè)花粉授精和遺傳后代的能力。一般情況下，植物花粉活力除受本身遺傳特性決定外，還受到保存溫度和相對(duì)濕度(花粉相對(duì)含水量)等因素的影響。通常，較低的溫度和相對(duì)濕度有利于花粉貯藏[1-3]。關(guān)于花粉的保存在花卉、果樹(shù)上研究較多，而在作物上較少。蓋鈞鎰研究結(jié)果表明[4]，在8～12 ℃干燥器中保存9 d的大豆花粉仍有良好的雜交效果，-3 ℃至-4 ℃低溫干燥處理可以保存大豆花粉生活力15 d，比自然條件延長(zhǎng)13～14 d。王慶美研究發(fā)現(xiàn)[5]，-6 ℃～-10 ℃低溫干燥條件下甘薯花粉的生活力可以保持6 d，其雜交結(jié)實(shí)率仍達(dá)30%左右，可解決親本花期相差1周左右的人工雜交問(wèn)題。王玉萍對(duì)馬鈴薯花粉超低溫保存的研究表明[6]，采用0 ℃、-10 ℃、-20 ℃分別處理12 h的逐步降溫預(yù)凍方法可獲得保存后高活力的花粉；冷凍前干燥處理18 h的花粉，保存后的生活力優(yōu)于干燥處理12 h和24 h的花粉。近年來(lái)隨著花粉原生質(zhì)體分離及遺傳轉(zhuǎn)化工作的開(kāi)展，花粉保存有了新的研究與應(yīng)用價(jià)值。

禾本科植物花粉壽命很短，小麥花粉粒在田間放置5 h后授粉結(jié)實(shí)率降低到6.4%[7]，這對(duì)雜交育種及其他研究極為不便。因此，研究花粉的貯藏條件對(duì)于延長(zhǎng)花粉壽命及開(kāi)展后續(xù)研究工作意義較大。目前關(guān)于小黑麥花粉活力的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬在不同溫度下對(duì)小黑麥花粉進(jìn)行貯藏，研究貯藏條件對(duì)小黑麥花粉活力的影響，旨在為小黑麥花粉短期和長(zhǎng)期保存提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為春性小黑麥新小黑麥1號(hào)、新小黑麥3號(hào)、新小黑麥4號(hào)和新小黑麥5號(hào)(簡(jiǎn)稱1、3、4、5號(hào))由石河子大學(xué)麥類作物研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

田間試驗(yàn)于2011～2012年在塔里木大學(xué)園藝試驗(yàn)站進(jìn)行，隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，重復(fù)2次，每小區(qū)種植10行，行長(zhǎng)3 m，行距15 cm，四周設(shè)保護(hù)行。試驗(yàn)地肥力中等，試驗(yàn)田施基肥220 kg/hm2尿素、150 kg/hm2磷酸二銨，拔節(jié)期隨水施80 kg/hm2尿素、60 kg/hm2KH2PO4，揚(yáng)花灌漿期施70 kg/hm2尿素、60 kg/hm2KH2PO4。拔節(jié)前噴施800 g/hm22,4D-丁酯除草。

揚(yáng)花期晴天上午十時(shí)左右，選取長(zhǎng)勢(shì)一致、無(wú)病蟲害、當(dāng)天開(kāi)花散粉的小黑麥麥穗10個(gè)，密封好帶回實(shí)驗(yàn)室，減去1/3穎殼，用鑷子撥出花藥，將散出的新鮮花粉裝入1.5 ml凍存管，在室溫、4 ℃、-20 ℃、液氮(-196 ℃)進(jìn)行貯藏，間隔一段時(shí)間用TTC染色法測(cè)定花粉活力，每個(gè)處理觀察2-3個(gè)制片，每片隨機(jī)取3個(gè)視野，保證每個(gè)視野下花粉數(shù)目為100個(gè)左右。以剛采集的新鮮花粉的活力即初始活力為對(duì)照。4 ℃、-20 ℃保存后的花粉需室溫下放置0.5 h后測(cè)定活力，而超低溫保存的花粉需要迅速置于自來(lái)水下沖洗5～10 min快速化凍，待恢復(fù)至室溫后進(jìn)行測(cè)定，記錄不同溫度保存前后花粉的活力，計(jì)算花粉活力相對(duì)保持率?；ǚ刍盍ο鄬?duì)保持率=保存后花粉活力/保存前花粉活力×100%。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理與分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，用Microsoft Excel 2003軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 室溫貯藏對(duì)小黑麥花粉活力的影響

圖1 室溫貯藏對(duì)小黑麥花粉活力(%)的影響

表1 室溫下小黑麥花粉活力(Y ，%)與時(shí)間(x)的擬合方程

將新鮮的小黑麥花粉置于室溫下保存，每隔1h測(cè)定活力，結(jié)果表明：在室溫條件下兩處理小黑麥花粉的活力均隨著時(shí)間延長(zhǎng)均呈現(xiàn)急劇下降趨勢(shì)(如圖1)。對(duì)小黑麥花粉活力(Y，%)和保存時(shí)間(x)進(jìn)行擬合(如表1所示)。由表1可知， 4個(gè)小黑麥品種的花粉活力(Y，%)和保存時(shí)間(x)之間均呈極顯著直線負(fù)相關(guān)關(guān)系。由圖1還可以看出，保存3h內(nèi)小黑麥花粉的活力在80%左右。超過(guò)3～4 h，花粉活力降低很快，保存7h后小黑麥花粉活力降至2%～12%，說(shuō)明室溫條件不適合小黑麥花粉的保存。

2.2 4℃貯藏對(duì)小黑麥花粉活力的影響

圖2 4 ℃貯藏對(duì)小黑麥花粉活力(%)的影響

表2 4 ℃下小黑麥花粉活力(Y ，%)與保存時(shí)間(x)的擬合方程

將新鮮小黑麥花粉裝入凍存管于4 ℃條件下進(jìn)行保存，每隔4 h測(cè)花粉活力。結(jié)果顯示：與室溫下保存相比，小黑麥花粉在4 ℃條件下的活力均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)較為緩慢下降趨勢(shì)(圖2所示)。對(duì)小黑麥花粉活力(Y，%)和保存時(shí)間(x)進(jìn)行擬合，結(jié)果顯示小黑麥品種的花粉活力(Y，%)和保存時(shí)間(x)之間呈顯著或極顯著水平的直線負(fù)相關(guān)關(guān)系(如表2)。

由圖2還可以看出，保存8 h后，1號(hào)、5號(hào)花粉的活力降低到60%左右，3號(hào)和4號(hào)降低為80%左右。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，花粉活力降低很快，且48 h后花粉活力接近降至0%，且此時(shí)不同品種花粉活力存在顯著差異，說(shuō)明4 ℃低溫貯藏可適當(dāng)延長(zhǎng)花粉活力，可用于小黑麥花粉的短期保存。

2.3 -20℃保存下小黑麥花粉活力研究

圖3 -20 ℃保存對(duì)小黑麥的花粉活力(%)的影響

表3 -20 ℃下小黑麥花粉活力(Y ，%)與保存時(shí)間(x)的擬合方程

將新鮮小黑麥花粉裝入凍存管，于-20 ℃條件下進(jìn)行保存，每隔4 h測(cè)花粉活力。結(jié)果表明，小黑麥花粉的活力均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)也呈現(xiàn)快速下降趨勢(shì)(圖3所示)。對(duì)小黑麥花粉活力(Y，%)和保存時(shí)間(x)進(jìn)行擬合顯示，Y和x之間呈顯著或極顯著水平的直線負(fù)相關(guān)關(guān)系(見(jiàn)表3)。由圖3可以看出，在-20 ℃保存下1號(hào)和5號(hào)下降速率快， 16 h后花粉活力接近0%， 3號(hào)和4號(hào)活力下降趨勢(shì)相對(duì)緩慢，16 h后花粉活力分別降低為11%和33%，說(shuō)明不同品種小黑麥花粉耐低溫儲(chǔ)存能力有顯著差異。與4 ℃保存相比，在-20 ℃保存下保存4 h后的花粉活力下降幅度比較顯著，小黑麥1號(hào)、5號(hào)花粉的活力降低到50%左右，而小黑麥3號(hào)和4號(hào)降低為65%左右。

2.4 超低溫(-196℃)下花粉活力研究

表4 液氮(-196℃)保存對(duì)小黑麥花粉活力(%)的影響

將新鮮花粉在硅膠干燥3 h后投入液氮，保存1 d、5 d和10 d后，在自來(lái)水下沖洗化凍，室溫放置0.5 h后測(cè)定花粉活力。測(cè)定結(jié)果(表4)表明，與ck相比，各品種在液氮中保存后的花粉活力降低幅度不大，且保存10 d后花粉活力相對(duì)保持率較高，在92%左右，說(shuō)明液氮超低溫冷凍保存是相對(duì)較為理想的保存方式，小黑麥花粉的活力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不會(huì)出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，理論上可以長(zhǎng)時(shí)間保存花粉。

3 討論

成熟的花粉具有豐富的貯藏物質(zhì)，能保證花粉獨(dú)立生活所需要的能量和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)?；ǚ鄣膲勖芏蹋诘蜏丨h(huán)境下細(xì)胞內(nèi)自由水部分被固化，花粉酶促反應(yīng)減慢，新陳代謝活動(dòng)得到抑制，衰老過(guò)程減慢,可以適當(dāng)延長(zhǎng)其生活力，但由于低溫代謝活動(dòng)仍繼續(xù)進(jìn)行，花粉生活力最終將會(huì)喪失。該研究結(jié)果表明：小黑麥花粉的活力在室溫條件下均隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈快速下降趨勢(shì)，說(shuō)明自然條件下小黑麥花粉活力壽命較短；在4 ℃保存下，花粉活力適當(dāng)延長(zhǎng)，保存效果較好；-20 ℃時(shí)花粉活力降低很快，花粉壽命較短，不適合保存，是由于花粉細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶，復(fù)蘇后細(xì)胞的生活力下降所致。液氮超低溫冷凍保存下的小黑麥花粉的活力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不會(huì)出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，花粉活力相對(duì)穩(wěn)定。因此小黑麥花粉短期保存可在4 ℃條件下，長(zhǎng)期保存可在液氮超低溫下進(jìn)行。由此可見(jiàn)，超低溫保存是相對(duì)較為理想的保存方式，這與前人的結(jié)果一致[8-10]，然而關(guān)于超低溫保存前后花粉生理生化變化和遺傳性狀穩(wěn)定性等機(jī)理仍有待于進(jìn)一步研究。

[1] Martínez-Gómez Pedro, Gradziel, Thomas M. low temperature storage of almond pollen[J].Hortscience,2002,37(4):691-692.

[2] Massimo Nepi L . Cresti, M . Guarnieri, E. Pacini. Effect of relative humidity on water content, viability and carbohydrate profile of Petunia hybrida and Cucurbita pepo pollen[J].Plant Systematics and Evolution,2010,284(2): 57-64.

[3] Wang Q L, Lu L D, Wu X Q, et a1. Pollen storage and viability determination[J]. Chin Bull Bot,2002,19(3):365-372.

[4] 蓋鈞鎰,胡蘊(yùn)珠,陳建民,等.保存大豆花粉生活力的試驗(yàn)[J].作物報(bào),1980,6(1):11-16.

[5] 王慶美,郗光輝,王大箴,等.甘薯花粉離體萌發(fā)及不同保存方法對(duì)其生活力的影響[J].萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 1996,13(3):186-189.

[6] 王玉萍,張峰,王蒂.馬鈴薯花粉的超低溫保存研究[J].園藝學(xué)報(bào),2003,30(6):683-686.

[7] 胡晉.花粉的保存和生活力測(cè)定[J].種子,1992(6):33-35.

[8] 王越,劉燕.觀賞植物種質(zhì)資源的超低溫保存[J].植物生理學(xué)通訊,2006,42(3): 559-566.

[9] 任秋萍,張斌斌.不同保存溫度對(duì)幾個(gè)梨品種花粉生活力的影響[J].北方園藝,2008(3): 3-5.

[10] 蓋樹(shù)鵬,蓋偉玲,鄭國(guó)生.不同條件下牡丹花粉的貯藏壽命[J].北方園藝,2011(18):104-106.