張　濤　梁少姍　諶達(dá)程　鄭春霞　曾彩虹　章海濤　陳慧梅　劉志紅

血栓性微血管病(TMA)是一類病理?yè)p傷，臨床上特征性表現(xiàn)為多器官微血管血栓形成，并引起血小板減少、微血管病性溶血和臟器功能障礙；其主要發(fā)病機(jī)制是血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[1]。TMA通常表現(xiàn)為溶血性尿毒綜合征(HUS)和血栓性血小板減少性紫癜(TTP)[2]，導(dǎo)致TMA的疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗磷脂抗體綜合征、惡性高血壓、先兆子癇、感染、藥物相關(guān)內(nèi)皮損傷及器官移植術(shù)后血管性排斥等[3-5]。

TMA以溶血性貧血、血小板減少和臟器缺血性失功為臨床表現(xiàn)，腎臟是主要的受累器官之一[6,7]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，腎臟存在TMA預(yù)示著腎臟的存活率和預(yù)后較差，及時(shí)的診斷和治療尤其關(guān)鍵[7，8]。目前，腎活檢是TMA病理診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但臨床上，TMA患者經(jīng)常存在凝血功能異常、血紅蛋白(Hb)下降、血小板低下和病情危重等禁忌證，難以及時(shí)行腎活檢并指導(dǎo)治療[9,10]。一些臨床表現(xiàn)和特異的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)提示TMA病變，包括Hb、血小板的下降，內(nèi)皮功能的異常，以及乳酸脫氫酶(LDH)的明顯上升等，但目前尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[11,12]。因此，本研究比較分析了TMA患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，以期提供TMA早期診治和預(yù)測(cè)預(yù)后的非創(chuàng)傷性方法。

對(duì)象和方法

研究對(duì)象選取2011年7月至2012年7月于南京軍區(qū)南京總醫(yī)院腎臟科疑診的TMA患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)腎功能損害(蛋白尿、血尿或腎功能不全，血清肌酐(SCr)>109.6 μmol/L);(2)微血管病性溶血性貧血(Hb<12 g/dl[11 g/dl,女])，外周血紅細(xì)胞碎片陽(yáng)性(>5個(gè))，LDH升高(LDH>240 U/L)；(3)病程中有血小板下降(最低值<100×109/L)；(4)臨床及腎臟病理資料完整，初次資料在免疫抑制治療或血漿置換前獲得。均隨訪至2013年10月，臨床資料不完整或隨訪少于12月患者予排除[13,14]。

入選建模組的疑診TMA患者共220例，其中腎活檢明確診斷TMA 51例。驗(yàn)證組包括46例另外疑診TMA患者和157例疑診TMA的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者，兩組分別確診TMA病變20例和27例，研究的設(shè)計(jì)流程見(jiàn)圖1。

圖1　研究流程圖

臨床資料和實(shí)驗(yàn)室結(jié)果收集患者年齡、性別、起病至確診時(shí)病程，并發(fā)癥及實(shí)驗(yàn)室檢查：活檢時(shí)24h尿蛋白定量、鏡下血尿、Hb、血小板、SCr、血清球蛋白、補(bǔ)體C3/C4、LDH、血管性血友病因子裂解蛋白酶13(ADAMTS13)酶活性及抗體。內(nèi)皮指標(biāo)包括血栓調(diào)節(jié)蛋白(THBD)、E選擇素、可溶性血管細(xì)胞黏附分子1 (sVCAM-1)和正常內(nèi)皮細(xì)胞(NEC)。

血清ADAMTS13活性是由熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(Fluorescence Resonance Energy TrANSFER,FRET)測(cè)定，此方法通過(guò)ADAMTS13蛋白酶水解重組的血管性血友病因子86(vWF86)-ALEXA FRET底物，從而解離ALEXA熒光物質(zhì)，使可檢測(cè)到的熒光增加，以此量化ADAMTS13的活性[15]。血清抗ADAMTS13 IgG抗體(SekisuiDiagnostics，美國(guó))、vWF的(Sunbiote，中國(guó))、THBD(Diaclone，法國(guó))、E選擇素(R&D，美國(guó))和sVCAM-1( R&D，美國(guó))都采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定。NEC在循環(huán)中的濃度，使用磁珠分選法(MACS，德國(guó))測(cè)定[16]。

病理資料與相關(guān)定義所有病例均在B 超引導(dǎo)下行腎活檢術(shù)。腎穿刺活檢組織經(jīng)甲醛固定,石蠟包埋,切片厚度為2 μm,腎組織進(jìn)行光鏡、電鏡及免疫熒光檢查。光鏡染色包括HE,PAS,PASM-Masson及Masson三色染色。腎活檢標(biāo)本要求腎小球數(shù)≥10個(gè)，間質(zhì)小血管和入球動(dòng)脈> 10個(gè)。TMA定義為至少一個(gè)腎小球或者小動(dòng)脈可見(jiàn)閉塞性纖維蛋白-血小板血栓，同時(shí)具有以下病變之一：(1)光鏡腎小球“雙軌樣”改變,電鏡腎小球內(nèi)皮下間隙疏松、增寬；(2)腎小球袢腔內(nèi)纖維素樣血栓和(或)變形的紅細(xì)胞；(3)動(dòng)脈管腔內(nèi)纖維素樣血栓和(或)變形的紅細(xì)胞；(4)動(dòng)脈黏液樣變性、動(dòng)脈蔥皮樣改變或動(dòng)脈內(nèi)膜纖維性增生；(5)腎皮質(zhì)壞死[7,17]。

SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)為1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修訂版SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[18]。隨訪腎臟終點(diǎn)事件包括SCr倍增、死亡或進(jìn)入終末期腎病(ESRD)，ESRD定義為估算的腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)<15 ml/(min·1.73m2)或進(jìn)入維持性腎臟替代治療。腎功能穩(wěn)定定義為SCr維持正常范圍或上升少于初發(fā)的50%。腎存活率定義為隨訪中未進(jìn)入ESRD或未達(dá)死亡患者的比例，人生存率定義為隨訪存活患者所占比例。

統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 19.0軟件錄入和整理資料并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間資料比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)。Logistic回歸用于與TMA相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的綜合分析，并采用受試者工作特征(ROC)曲線獲取分界值，以最佳擬合模型的曲線下面積(AUC)計(jì)算，進(jìn)行靈敏度和特異的評(píng)價(jià)。并運(yùn)用Bootstrap方法和Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)交叉驗(yàn)證所建模型的擬合度。累計(jì)腎臟生存率采用Kaplan-Meier生存概率計(jì)算。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

結(jié)　　果

一般情況據(jù)腎活檢病理結(jié)果，入建模組的220例疑診患者中，分為TMA組(n=51)和非TMA組(n=169)，兩組患者年齡、性別無(wú)明顯差異。TMA組中特發(fā)的HUS/TTP患者15例(29.4%)，繼發(fā)的 TMA患者36例(70.6%)，繼發(fā)疾病主要為自身免疫性疾病29例(56.9%)，余為妊娠5例(9.8%)，惡性高血壓1例(1.96%)，器官移植1例(1.96%)(表1)。

表1　TMA患者和非TMA患者腎活檢時(shí)的臨床資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)

續(xù)表1

實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)中兩組間在血小板、Hb、LDH、SCr、ADAMTS13活性和THBD 有明顯差異(均P≤0.001)，TMA組患者較非TMA組發(fā)病時(shí)SCr、LDH和THBD水平明顯增高，而Hb、血小板、ADAMTS13活性水平都明顯減低，而24h尿蛋白、尿沉渣、補(bǔ)體、球蛋白、NEC、E選擇素、VCAM及ADAMTS13抗體、vWF水平無(wú)顯著差異。兩組隨訪12月TMA組患者預(yù)后更差，腎存活率僅為54.9 %，非TMA組腎存活率為74.6%,兩組間有差異(P=0.015)，1年累計(jì)腎臟Kaplan-Meier生存率兩組間差異顯著(P=0.002,圖2)。隨訪觀察兩組間人存活率無(wú)明顯差異(P=0.115)(表1)。

圖2　TMA組患者和非TMA組腎生存率的比較

Logistic回歸模型的建立基于建模組患者的實(shí)驗(yàn)室資料， 6個(gè)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(血小板、Hb、LDH、SCr、ADAMTS13活性和THBD)在TMA組和非TMA組間有顯著差異(均P<0.05)，以P值0.05作為納入界值，這6個(gè)指標(biāo)被進(jìn)一步納入多因素Logistic回歸分析，用逐步法建立模型，綜合分析結(jié)果表明SCr，血小板，LDH和ADAMTS13活性為腎臟TMA病變的有效預(yù)測(cè)指標(biāo)(均P<0.05，表2)，建立Logistic 回歸方程：

Logit P=-0.371-0.002×ADAMTS13活性+0.140×SCr+0.004×LDH-0.010×PLT

以上方程診斷TMA病變的預(yù)測(cè)概率擬合ROC曲線，AUC為0.800(95%CI 0.723～0.877，P<0.001，圖3)。當(dāng)分界值取0.248時(shí)，大于界值即為TMA,這個(gè)診斷模型的敏感度為81.6%，特異度為66.9%。

圖3　診斷模型預(yù)測(cè)220例建模組中TMA的ROC曲線

表2　TMA相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的Logistic回歸分析結(jié)果(n=220)

診斷模型的驗(yàn)證應(yīng)用Bootstrap方法對(duì)診斷模型進(jìn)行驗(yàn)證，這結(jié)合四個(gè)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)診斷模型的交叉驗(yàn)證AUC為0.803，校準(zhǔn)曲線的截距和斜率分別為0.07和0.64。運(yùn)用Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)診斷模型，其擬合度良好(P=0.489)，交叉驗(yàn)證兩曲線間關(guān)聯(lián)緊密。

在獨(dú)立的46例疑診患者中進(jìn)行這一診斷模型的進(jìn)一步驗(yàn)證。這46例患者的相關(guān)臨床資料見(jiàn)表3，其中腎活檢診斷為TMA的患者20例(43.5%)，非TMA患者26例(56.5%)。TMA診斷模型在46例患者中預(yù)測(cè)TMA病變的AUC為0.815 (95%CI 0.685～0.946，P<0.001，圖4)。取分界值0.248，這組患者中診斷模型的敏感度為75%，特異度為84.6%。

表3　獨(dú)立的驗(yàn)證組患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(n=46)

圖4　診斷模型在獨(dú)立的驗(yàn)證組中驗(yàn)證的ROC曲線

在157例疑診有TMA病變的SLE患者中再次進(jìn)行了這一診斷模型的驗(yàn)證，這組患者中腎活檢診斷為TMA的患者27例(17.2%)，非TMA患者130例(82.8)，兩組患者間年齡、性別無(wú)差異，在這組患者中診斷模型預(yù)測(cè)TMA病變的AUC達(dá)0.852(P<0.001，圖5)。取分界值為0.248時(shí)，這個(gè)診斷模型的敏感度為83.3%，特異度為73.0%。

圖5　診斷模型在SLE患者組中驗(yàn)證的ROC曲線

表4　系統(tǒng)性紅斑狼瘡驗(yàn)證組患者的臨床資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(n=157)

討　　論

TMA這一病理?yè)p傷的發(fā)病機(jī)制目前仍未清楚，可能是多種機(jī)制聯(lián)合作用，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凝血纖溶障礙、自身免疫及遺傳等。病因更是多種多樣，如感染、藥物、化學(xué)物質(zhì)等，故TMA發(fā)病率低，但并不罕見(jiàn)，特別是繼發(fā)性TMA，目前報(bào)道繼發(fā)TMA又以SLE為首[3,7,19,20]。TMA臨床表現(xiàn)復(fù)雜，癥狀缺乏規(guī)律性，目前診斷標(biāo)準(zhǔn)尚難以統(tǒng)一[21,22]，確診需要腎活檢證實(shí)存在微血管血栓，因此，無(wú)創(chuàng)的診斷方法有廣闊的運(yùn)用前景。本研究基于TMA相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)變化，建立了新診斷模型，并進(jìn)行了系統(tǒng)驗(yàn)證，這一診斷模型無(wú)創(chuàng)，可準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)組織學(xué)上的TMA病變。而據(jù)目前資料，這是首次提出預(yù)測(cè)TMA病變的無(wú)創(chuàng)診斷模型。

既往研究表明，TMA病理變化和患者腎臟預(yù)后顯著相關(guān)，TMA患者其腎臟預(yù)后差[23,24]。本研究中腎活檢確診TMA的患者腎臟預(yù)后不良，腎臟終點(diǎn)事件發(fā)生率高于非TMA者，1年腎累計(jì)生存率明顯低于非TMA患者，這也和相關(guān)報(bào)道[25]。根據(jù)腎活檢病理是否為TMA分組，建立的Logistic回歸模型中包含4個(gè)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(SCr，LDH，血小板和ADAMTS13活性)，這些實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)易于檢測(cè)，便于動(dòng)態(tài)觀察。

這一診斷模型中4個(gè)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與臨床癥狀和(或)TMA組織學(xué)病變明顯相關(guān)。TMA病變的臨床主要特征之一即為血栓形成，血小板減少，約90%的患者可出現(xiàn)血小板減少，嚴(yán)重者血小板下降明顯，可達(dá)1萬(wàn)/ml以下，血小板減少程度和持續(xù)時(shí)間與腎功能衰竭可不一致[26]。相關(guān)報(bào)道顯示TMA病變患者中腎臟受累達(dá)40%～80%，表現(xiàn)為尿檢和腎功能異常[7]，本研究患者皆有腎臟受累，可能與患者皆為腎內(nèi)科首次診斷有關(guān)。同時(shí)LDH的水平變化通常也反映組織缺血及溶血程度，是臨床經(jīng)常監(jiān)測(cè)病情變化的指標(biāo)之一，但LDH異常在其他臟器損傷中也常常觀察到[27,28]。ADAMTS13在TMA研究進(jìn)展中備受關(guān)注，近期研究表明ADAMTS13 的嚴(yán)重缺乏與遺傳性TTP明確相關(guān)，ADAMTS13活性常低于正常人的5%，但ADAMTS13活性減低也報(bào)道見(jiàn)于妊娠、肝病、自身免疫性疾病及慢性炎癥患者[29,30]。所以，這些實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)異常是常見(jiàn)和非特異性的，單個(gè)指標(biāo)運(yùn)用于TMA的診斷是很困難的，本研究采用Logistic回歸綜合分析相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，由于Logistic回歸中計(jì)算結(jié)果與自變量的分布類型無(wú)關(guān)，這使其分析較常規(guī)分析更穩(wěn)健，可很好地處理協(xié)變量問(wèn)題，并動(dòng)態(tài)連續(xù)觀察回歸指標(biāo)，從多變量中篩選出相關(guān)性好的診斷指標(biāo)，構(gòu)建可靠的回歸方程，有助于臨床診斷[31]。

本研究中構(gòu)建的Logistic回歸方程，AUC達(dá)0.800，預(yù)測(cè)概率取界值0.248，這一模型診斷TMA病變具有極好的靈敏度(81.6%)和良好的特異度(66.9%)，交叉檢驗(yàn)也說(shuō)明這一診斷模型擬合度良好。進(jìn)一步在46例獨(dú)立的疑診TMA患者中的驗(yàn)證AUC為0.815，相同界值下敏感度為75%，特異度為84.6%。而在SLE患者中的驗(yàn)證有更大的AUC和更高的靈敏度和特異度，在SLE患者中有更高的檢驗(yàn)效率和診斷準(zhǔn)確性。這對(duì)SLE患者腎臟病理進(jìn)行分類、預(yù)后判斷和選擇治療都有益處，而且這還是非創(chuàng)傷性的診斷方法，在臨床應(yīng)用極具潛力。

總之，TMA患者腎臟預(yù)后不良，需要及時(shí)診治，本研究提出了包含4個(gè)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的診斷模型，為臨床提供了無(wú)創(chuàng)的TMA診斷方法，相關(guān)驗(yàn)證也說(shuō)明了該模型具有較高的診斷價(jià)值。當(dāng)然，本研究也有其局限性。首先，這是回顧性研究，需要前瞻性隊(duì)列研究進(jìn)行驗(yàn)證；其次，入組患者疾病譜較窄，繼發(fā)因素以自身免疫疾病患者為主，其他病因例數(shù)較少；驗(yàn)證中也使用了非獨(dú)立的數(shù)據(jù)，無(wú)法更深入地評(píng)估這一診斷模型的實(shí)用性。

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