溶藻弧菌dldh基因突變株的構(gòu)建及其生物學功能研究

龐歡瑛陳立明黃郁蔥簡紀常魯義善吳灶和

（1. 廣東海洋大學 水產(chǎn)學院，湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，湛江 524088；3.廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制重點實驗室，湛江 524088；4. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學院，廣州 510225）

溶藻弧菌dldh基因突變株的構(gòu)建及其生物學功能研究

龐歡瑛1，2，3陳立明1，2，3黃郁蔥1，2，3簡紀常1，2，3魯義善1，2，3吳灶和2，3，4

（1. 廣東海洋大學 水產(chǎn)學院，湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，湛江 524088；3.廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制重點實驗室，湛江 524088；4. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學院，廣州 510225）

為揭示二氫硫辛酰胺脫氫酶（Dihydrolipoamide dehydrogenase，DLDH）在溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）致病中的作用，以pRE112自殺質(zhì)粒為載體，應(yīng)用插入失活突變法構(gòu)建dldh基因插入突變株，比較分析了野生株ZJ03與缺失株ZJ03Δdldh在生長、泳動能力、酶活性、生物膜形成、致病性的表現(xiàn)。結(jié)果表明，dldh基因的突變，使溶藻弧菌生長的遲緩期延長、泳動能力顯著減弱（P＜0.05），酶活性顯著降低（P ＜0.05），生物膜生成顯著減少（P ＜0.05），對石斑魚（Epinephelus coioides）的致病性也明顯減弱（P ＜0.05）。本研究為從細菌能量代謝角度研究弧菌的致病機制提供理論依據(jù)。

溶藻弧菌 dldh 缺失株 生物特性

二氫硫辛酰胺脫氫酶（Dihydrolipoamide dehydrogenase，DLDH）又稱硫辛酰胺脫氫酶或二氫硫辛酸脫氫酶，它廣泛存在于各種生物中，主要分布在生物的線粒體或質(zhì)膜中［1］。DLDH是3種a丙酮酸

脫氫酶復合體不可或缺的組成部分，它與谷光甘肽還原酶、汞還原酶［2］、硫氧還蛋白和錐蟲胱甘肽還原酶（Trypanothione reductase）［3］同屬黃素蛋白氧化還原酶家族［4］，在能量代謝中起重要作用。然而，近年來的研究發(fā)現(xiàn)DLDH不僅行使氧化還原酶的功能，在細菌感染過程中也起重要作用。在豬鏈球菌（Streptococcus suis）中，DLDH為膜蛋白，是介導細菌粘附的重要成分之一［5］，參與感染的發(fā)生。在雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum）中，DLDH 是毒力決定因子之一［6］。DLDH在肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）中與幾種糖類的運輸有關(guān)，dldh的缺失導致肺炎鏈球菌不能輸入和利用半乳糖、綿子糖和水蘇糖，而且?guī)缀鯁适Ц腥緞游锏哪芰Γ?］。由此可見DLDH雖然不編碼毒力因子，但在細菌感染中起重要作用。

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是一種革蘭氏陰性短桿菌，廣泛存在于海水中，是水生動物弧菌病的主要病原菌之一［8-10］，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。此外，該菌可導致人類的腹瀉、中耳炎以及敗血癥等多種疾?。?1-12］，嚴重危害人類健康。

與其他病原菌一樣，弧菌的致病性主要取決于其與宿主之間的相互作用。弧菌通過黏附侵襲，在宿主體內(nèi)增殖，產(chǎn)生毒素等過程，造成宿主正常功能紊亂而引起死亡等。目前對溶藻弧菌致病機制的研究主要集中在毒力因子的研究上，但是現(xiàn)已證明，一些弧菌的毒力相關(guān)基因被敲除后，細菌仍然具有感染力［13］?？梢姡【母腥臼怯蓮碗s的調(diào)控機制控制的，不僅僅取決于毒力因子。本研究以溶藻弧菌強毒株ZJ03為對象，通過基因重組技術(shù)構(gòu)建dldh基因插入缺失突變株，并通過與野生株的對比研究，探討DLDH的生物學功能的改變，為從能量代謝角度研究弧菌的致病機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 溶藻弧菌野生株ZJ03，由本試驗室從廣東省湛江港海域患病紅笛鯛（Lutjanus erythopterus）魚體中分離并保存［14］；大腸桿菌MC1061（λpir）和S17-1（λpir）自殺質(zhì)粒pRE112由中國科學院水生生物研究所謝海俠老師惠贈。

1.1.2 試劑 TIANamp Bacteria DNA Kit購自北京天根生化科技有限公司。Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司。Easy Pfu DNA聚合酶、Easy PureTMQuick Gel Extraction Kit、Easy PureTMPlasmid MiniPrep Kit t購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。所有的引物合成和序列分析均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 溶藻弧菌總DNA的提取 將溶藻弧菌ZJ03菌株涂布于TSA平板，挑選單菌落接種于TSB（2% NaCl）培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)18 h。取1 mL菌液于離心管中，10 000 r/min離心5 min收集菌體，參照試劑盒說明書提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 溶藻弧菌dldh基因片段的克隆 根據(jù)GenBank上登錄的溶藻弧菌dldh基因序列（登錄號為AGK62253）設(shè)計1對引物：上游引物P1：CGGGGTACCTTTGGGACTCTACTGACGCTCT（下劃線為Kpn I位點），下游引物P2：CGAGCTCCGCTTCTTTTTCAGTCTTACCAAC（下劃線為Sac I位點），以提取的溶藻弧菌總DNA為模板進行PCR擴增，擴增包含部分NADH及FAD結(jié)合區(qū)域的片段，預計片段長度為615 bp。反應(yīng)條件為：94℃預變性4 min；94℃40 s，65℃ 40 s，72℃ 60 s，共31個循環(huán)，再72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，用DNA 膠回收試劑盒切膠回收。

1.2.3 自殺質(zhì)粒PRE112的提取 使用全士金公司的Easy Pure Plasmid MiniPrep Kit試劑盒提取pRE112質(zhì)粒，-20℃保存。

1.2.4 酶切及產(chǎn)物純化回收、連接 將回收擴增片段及提取質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Sac I分別進行酶切。將酶切回收后的dldh缺失片段與pRE112質(zhì)粒載體通過T4連接酶連接構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒pRE-Δdldh，并轉(zhuǎn)化入E. coli MC1061感受態(tài)細胞。

1.2.5 溶藻弧菌突變株的構(gòu)建 （1）分別培養(yǎng)含有pRE-△dldh質(zhì)粒的大腸桿菌S17-1和野生型溶藻弧菌ZJ03至OD600達到0.5。（2）分別取200 μL大腸桿菌S17-1和50 μL溶藻弧菌混勻，6 000 r/min離心5 min，徹底去上清，加入60 μL TSB 液體培養(yǎng)

基重懸菌體，將細菌按30 μL/spot接種于無抗性的TSA固體培養(yǎng)基平板上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。（3）將TSA平板上的菌落用TSB液體培養(yǎng)基沖洗下來，并稀釋接種于含有氯霉素（Cm終濃度為25 μg/mL）的平板上，28℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h。（4）挑取單菌落，以dldh片段引物P1、P2，氯霉素基因引物Cm1（GGCCCTAA TACCTGTGACGGAAGAT）、Cm2（CGGGCCCTATCACTTATTCAGGCGT）以及Cm1、P2進行PCR，反應(yīng)條件為：94℃預變性4 min；94℃ 40 s，61℃ 40 s，63℃ 40s，72℃ 60 s，共31個循環(huán)，再72℃延伸 10 min，篩選插入突變株并命名為ZJ03△dldh。

1.2.6 突變株的遺傳穩(wěn)定性檢驗 將插入突變株△dldh在TSA培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)40代，利用引物Cm1、Cm2和Cm1、P2，PCR檢測突變株第40代的插入片段的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.7 突變株與野生株生長曲線的比較 將插入突變株ZJ03△dldh與野生株ZJ03分別接種于新鮮TSB培養(yǎng)基，28℃過夜培養(yǎng)，將吸光值調(diào)至0.5（OD600），按照1∶100的比例分別接種到含有新鮮培養(yǎng)基的干凈試管中（各18支），28℃震蕩培養(yǎng)，每隔1 h將對應(yīng)試管取出測定OD600值。以時間為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制生長曲線，試驗重復3次。

1.2.8 細菌泳動檢測 挑取野生株溶藻弧菌及插入突變株ZJ03△dldh的單菌落，接種于含瓊脂0.3%的TSA的平板上。28℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，測定泳動圈直徑，試驗重復3次。

1.2.9 酶活測定 二氫硫辛酰胺脫氫酶活性測定參照文獻［15］進行，具體方法如下。

（1）分別培養(yǎng)野生株溶藻弧菌及插入突變株△dldh至OD600為0.5，然后分別進行超聲波破碎，取等量上清。（2）按照以下混合反應(yīng)液，首先在試管中加入 50 mmol/L、pH7.0 的磷酸鹽緩沖液 2.7 mL，于 37 ℃水浴保溫 10 min，依次加入0.6 mmol/L硫辛酰胺0.1 mL、1 mmol/L NADH 0.1 mL和蛋白液0.1 mL，立即混勻，使用紫外分光光度計于 340 nm 處檢測吸光值，每 5 min 讀數(shù)1次，連續(xù)測定 15 min。每組試驗重復3次，取平均值。二氫硫辛酰胺脫氫酶活性單位定義為：在上述反應(yīng)條件下每 min 氧化1 μmol NADH所需的酶量，為一個酶活性單位（U）。試驗重復3次。

1.2.10 生物膜檢測 生物膜檢測方法參照文獻［16］。將溶藻弧菌野生株及突變株單菌落劃線接種于TSA平板上，28℃恒溫培養(yǎng)過夜。用2 mL新鮮液體TSB培養(yǎng)基沖洗平板，調(diào)OD600至0.5。用新鮮液體培養(yǎng)基將菌液以1∶20的比例稀釋，然后接種到96孔板中，每孔300 μL，每菌種設(shè)6個平行。陰性對照為等量TSB液體培養(yǎng)基。將96孔板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)48 h。無菌去離子水洗滌96孔板，每孔加300 μL，每次洗滌輕敲并倒置晾干，連續(xù)3次。每孔加150 μL甲醇，進行20 min固定，室溫晾干，倒置30 min。每孔加150 μL結(jié)晶紫草酸銨染液室溫染色15 min，自來水小心沖洗，直至流水澄清，室溫晾干。每孔小心加入150 μL 95%的酒精，室溫放置30 min，測定OD570。試驗重復3次。

1.2.11 半致死率（LD50）檢測 利用斜帶石斑魚考察ZJ03和ZJ03Δdldh的致病力，具體操作如下：分別接種ZJ03和Δdldh的單菌落至TSB液體培養(yǎng)基中28℃，200 r/min搖床培養(yǎng)18 h，10 000×g離心5 min，收集菌液沉淀，用pH7.2的PBS清洗沉淀3次。用PBS調(diào)OD600至0.5，菌液的濃度約為108CFU/mL。將兩株細菌菌液分別用PBS稀釋至0、104、105、106、107、108CFU/mL，每個濃度注射20尾，每尾魚腹腔注射0.1 mL。記錄15 d內(nèi)魚體死亡數(shù)目。觀察死魚癥狀，并分離死魚體內(nèi)的細菌于TSA平板上培養(yǎng)，PCR檢測16S rDNA，測序后確認死于溶藻弧菌感染。參照改進寇氏法計算半數(shù)致死量：

lgLD50=Xk-d（∑Pi-0.5）

其中，Xk為最大對數(shù)劑量，d為相鄰的兩組對數(shù)劑量之差數(shù)，Pi為死亡率，i為組號。

2 結(jié)果

2.1 插入突變株的構(gòu)建

利用引物P1、P2克隆dldh基因615 bp片段（圖1-A），將其插入自殺質(zhì)粒載體pRE112中，并通過同源重組插入溶藻弧菌基因組DNA中。利用引物Cm1、Cm2通過菌落PCR檢測，可以在溶藻弧菌中擴出936 bp的氯霉素條帶（圖1-B），而利用Cm1、P2引物可以擴增得到長度為1 596 bp的目的條帶，

說明插入突變株構(gòu)建成功（圖1-C）。

圖1 插入突變株ZJ03△dldh構(gòu)建過程

2.2 插入失活突變株遺傳穩(wěn)定性檢測

將突變株ZJ03△dldh在TSA平板上連續(xù)傳代培養(yǎng)40代，利用引物Cm1、Cm2和Cm1、P2檢測突變株的遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果表明，突變株在培養(yǎng)40代后仍能能擴出936 bp氯霉素條帶（圖2-A）和1 596 bp的插入片段（圖2-B），表明插入片段可以在溶藻弧菌中穩(wěn)定遺傳。

圖2 ZJ03△dldh的遺傳穩(wěn)定性分析

2.3 生長曲線的測定

通過對溶藻弧菌野生株及插入突變株△dldh在TSB培養(yǎng)基中的生長曲線進行比較可以看出，dldh基因的突變對溶藻弧菌的生長具有一定的影響。在遲緩期，野生株經(jīng)過5 h生長后 OD600達0.5，而突變株OD600達0.5時需要7 h；在指數(shù)期，野生株經(jīng)過10 h生長后 OD600達2，而突變株OD600達2時需要11 h；在穩(wěn)定期，兩株細菌在經(jīng)過27 h生長后菌體濃度OD600均在2.7左右（圖3）。從生長曲線可以看出，dldh基因的突變對細菌生長的影響主要表現(xiàn)在遲緩期，進入指數(shù)期后生長情況與野生株差別不大。

圖3 野生株和突變株的生長曲線

2.4 細菌泳動試驗

將野生溶藻弧菌ZJ03與突變株ZJ03△dldh接種于泳動平板上，其泳動結(jié)果如圖4所示。野生株泳動圈為3.51±0.15，突變株為2.11±0.22，根據(jù)泳動圈直徑統(tǒng)計分析可知dldh缺失后溶藻弧菌的泳動能力顯著降低（P＜0.05）。

2.5 酶活測定

通過酶活性測定發(fā)現(xiàn)，突變株ZJ03△dldh單位活性為（0.091±0.005）U/mg，而野生株單位酶活

性為（0.316 ±0.008）U/mg，可見敲除株酶活性顯著降低（P＜0.05），dldh的突變會影響溶藻弧菌的二氫硫辛酰胺脫氫酶活性。

圖4 野生株和突變株的泳動能力

2.6 生物膜檢測

通過檢測發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌野生株與突變株的生物膜形成能力如圖5所示。兩株弧菌的生物膜形成有顯著差異（P＜0.05），說明dldh的缺失會影響溶藻弧菌生物膜的形成。

圖5 野生株和突變株的生物膜

2.7 LD50檢測結(jié)果

將ZJ03和ZJ03Δdldh分別注射斜帶石斑魚，攻毒結(jié)果如表1所示。由試驗結(jié)果可知，dldh的缺失使野生型溶藻弧菌的毒力下降約兩個數(shù)量級。LD50檢測結(jié)果表明，dldh影響了溶藻弧菌的致病力。毒力下降的原因可能是由于缺失株在魚體內(nèi)的能量代謝受阻，對魚體內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)性降低，增值能力減弱，從而導致感染力下降。

3 討論

突變株的構(gòu)建方法主要有一次同源重組和二次同源重組方法［17］。本試驗采用一步同源重組法構(gòu)建dldh插入失活突變株，將dldh內(nèi)部包含部分NADH及FAD結(jié)合區(qū)域的片段克隆到自殺載體pRE112上，通過接合轉(zhuǎn)移，利用同源重組將載體質(zhì)粒整合于溶藻弧菌染色體上，構(gòu)建插入失活突變株ZJ03Δdldh，并對其相關(guān)的生物學變化進行了比較研究。

表1 不同菌株的LD50

dldh作為能量代謝關(guān)鍵酶類，對生物的生長起著重要的作用。在對肺炎鏈球菌的研究中發(fā)現(xiàn)，dldh的缺失使細菌在棉子糖和水蘇糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上的生長顯著下降［18］。在本研究中dldh基因的突變對細菌生長的影響主要表現(xiàn)在遲緩期的延長上，這可能是由于dldh的缺失造成初始期的能量代謝障礙所致［7］。

端生鞭毛以及眾多的周生鞭毛都會影響弧菌的泳動力。而細菌的鞭毛泳動能力與黏附力和侵襲力相關(guān)［19］。在豬鏈球菌的研究中發(fā)現(xiàn)，dldh在豬鏈球菌黏附細胞的過程中發(fā)揮重要作用［5］。在布氏錐體蟲中，研究者發(fā)現(xiàn)dldh基因在鞭毛區(qū)域大量分布［20］。在本研究中，ZJ03Δdldh的泳動力顯著減弱，表明dldh與溶藻弧菌的泳動能力相關(guān)聯(lián)。

生物膜的形成是細菌定植在宿主細胞膜表面，從而導致耐藥性和免疫防御的一種多細胞行為［21］?；【锬さ男纬膳c一些特定的結(jié)構(gòu)（纖毛、鞭毛和胞外多糖等）以及復雜的調(diào)控系統(tǒng)息息相關(guān)［22］。對葉緣焦枯病菌（Xylella fastidiosa）體外生物膜形成過程研究發(fā)現(xiàn)，dldh基因的表達量顯著提高［23］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ZJ03Δdldh缺失株和野生株的生物膜形成差異顯著（P＜0.05），提示dldh參與了溶藻弧菌生物膜的形成過程。

對肺炎鏈球菌研究表明dldh的缺失使DLDH酶活性完全喪失［18］，本研究也發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌dldh的NADH及FAD結(jié)合區(qū)域突變后顯著影響細菌DLDH酶活性（P＜0.05）。此外，dldh缺失的肺炎鏈球菌還喪失了對小鼠的感染力［18］，本研究發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌dldh的缺失顯著影響細菌的致病性，表現(xiàn)為對斜帶石斑魚的LD50下降約100倍?？傊?，本研究初步表

明dldh作為能量代謝基因在溶藻弧菌的致病中起一定作用，但后續(xù)仍需要補充更多的致病相關(guān)試驗來闡明其致病機理。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建dldh基因插入突變株ZJ03Δdldh。與野生株的對比研究表明，該突變株生長的遲緩期延長、泳動能力顯著減弱（P＜0.05），酶活性顯著降低（P＜0.05），生物膜生成顯著減少（P＜0.05），對石斑魚的致病性也明顯減弱（P＜0.05）。

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（責任編輯 李楠）

Construction and Characterization of a Mutant of Vibrio alginolyticus ZJ03 Δdldh Strain

Pang Huanying1，2，3Chen Liming1，2，3Huang Yucong1，2，3Jian Jichang1，2，3Lu Yishan1，2，3Wu Zaohe2，3，4
（1. Fisheries College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088；3. Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutions，Zhanjiang 524088；4. Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225）

Vibrio alginolyticus, a gram-negative bacterium has been described to be among the most common and economically important aquatic pathogen of fish and shellfish. Dihydrolipoamide dehydrogenase （DLDH）is homodimeric flavoproteins that catalyse the NAD+dependent reoxidation of dihydrolipoamide in a number of multienzyme complexes. This enzyme classically involved in energy metabolism. To identify DLDH’s role during infection, dldh gene deletion strain （ZJ03Δdldh）were constructed using the insertion mutation method. With the pRE112 suicide plasmid as the carrier, the Overlap PCR and homologous recombination technology were used to construct the mutant strains. Furthermore, the changes of the physiology and pathogenicity of ZJ03Δdldh mutant strains compared with the strain ZJ03, such as growth, swarming ability, biofilm and LD50 were investigated. The growth curve showed that the mutant grew slowly in lag phase compared to the wildtype strain, and the swarming ability, enzyme activity and biofilm formation of ZJ03Δdldh mutant strains showed significant reduced（P＜0.05）. The fish lethal test showed that the virulence of the ZJ03Δdldh mutant strains was 102times lower than the ZJ03 strain. In conclusion, the ZJ03Δdldh mutant strains were constructed successfully, and this study showed that enzymes classically involved in energy metabolism may play an important role in pathogenic mechanism of V. alginolyticus.

Vibrio alginolyticus dldh mutant Biological characteristics

2014-05-30

國家科技支撐計劃（2012BAD17B02，2012 BAD17B03），廣東省自然科學基金項目（S2013040014562）

龐歡瑛，女，博士，講師，研究方向：水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害；E-mail：phying1218@163.com

簡紀常，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)經(jīng)濟動物免疫學及病害控制；E-mail：jianjc@gmail.com