李正 單輝輝 齊雅琳 劉磊 韓素貞

（首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048）

甘肅酒泉等地區(qū)豆科植物根瘤菌的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育分析

李正 單輝輝 齊雅琳 劉磊 韓素貞

（首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048）

采用16S rDNA PCR-RFLP和16S rDNA全序列分析技術(shù)對采集自甘肅酒泉、嘉峪關(guān)等8個(gè)地區(qū)的豌豆、菜豆等幾個(gè)不同豆科植物根瘤中分離的53株供試菌株和9株參比菌株進(jìn)行了遺傳和系統(tǒng)發(fā)育分析。16S rDNA PCR-RFLP結(jié)果表明，在77.5%的相似性水平上全部供試菌株聚成5個(gè)分支。分支I為Sinorhizhobium-Rhizobium分支，分支II為Agrorhizobium-Bradyrhizobium分支，分支III是未知供試菌組成的分支，分支IV為Mesorhizobium分支，分支V為2株未知供試菌組成的分支。在89.8%的相似性水平上，分支I包括2個(gè)亞分支：亞分支1由CNU1008等14株供試菌組成，與Sinorhizobium meliloti LISPA1002T菌株聚在一起；亞分支2包括6株未知菌，與Rhizobium leguminosarum USDA 2370T聚在一起。分支II包括3個(gè)亞分支：亞分支1包括CNU 1041等4株菌，與2株Agrobacterium tumefaciens IAM 13129T和 IAM 13569T聚在一起；亞分支2包括5株菌，與Bradyrhizobium japonicum USDA 6T菌株聚在一起；亞分支3包括3株未知菌。選取各分支和亞分支的代表菌株進(jìn)行16S rDNA測序，結(jié)果表明，兩種分析方法在結(jié)果上具有較好的一致性。處于分支I的Sinorhizobium亞分支的菌株，與S.fredii和S.meliloti的相似性達(dá)到99%，該亞分支菌株的確切系統(tǒng)發(fā)育地位有待于DNA-DNA雜交來確定。處于分支I的Rhizobium亞分支的菌株，與R.giardinii的相似性達(dá)到99%，與R.etli的相似性為98%。同樣，該亞分支的確切地位有待于DNA-DNA雜交來確定。處于分支II Agrobaterium亞分支的菌株與A.rubi的相似性達(dá)到99%。處于分支II Bradyrhizobium 亞分支的菌株，與B.liaoningense 的相似性達(dá)到99%。

根瘤菌 16S rDNA PCR-RFLP分析 16S rDNA全序列分析

根瘤菌與豆科植物的共生固氮體系是生物固氮中效率最高的體系，約占生物固氮總量的65%。該體系具有固氮能力強(qiáng)、固氮量大、抗逆能力強(qiáng)等特點(diǎn)，可以提高土壤肥力，對可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。

16S rDNA已被作為一個(gè)分子指標(biāo)，廣泛地應(yīng)用于各種細(xì)菌的遺傳特征和分子差異的研究［1］。16S rDNA PCR-RFLP在研究根瘤菌的遺傳多樣性方面因其簡便快捷的特點(diǎn)，應(yīng)用已較成熟，與16S rDNA全序列分析結(jié)果具有很好的一致性［2，3］。

甘肅酒泉、敦煌、嘉峪關(guān)、甘谷、麥積山、德隆、涇川等地區(qū)屬河西走廊地區(qū)，氣候干燥寒冷，降水短缺。這些地區(qū)豆科植物根瘤菌種質(zhì)資源的研究報(bào)道較少。本研究通過16S rDNA PCR-RFLP和16S rDNA全序列分析對這些地區(qū)大豆根瘤菌多樣性和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行研究，旨為這些根瘤菌菌株的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

將采集自甘肅省河西走廊地區(qū)的根瘤用無菌水浸泡過夜，在無菌操作臺上用95%乙醇浸泡5 min，用0.1% HgCl2表面滅菌5 min，再用無菌水沖洗6次，然后用鑷子夾碎根瘤，擠出汁液，劃線接種于YMA培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)3-7 d后挑取單菌落劃線純化，進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢，將革蘭氏陰性（G-）桿菌作為供試菌［4，5］。如表1，本研究采用53株宿主為豌豆、蠶豆、菜豆等豆科作物的供試菌和9株參比菌。參比菌分屬于Sinorhizobium、Rhizobium、Agrobacterium、Mesorhizobium和Bradyrhizobium。

1.2 方法

1.2.1 16S rDNA PCR-RFLP DNA提取步驟詳見參考文獻(xiàn)［6］。引物P1為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA GAACGAACGCT-3'，其序列對應(yīng)于E.coli 16S rDNA基因第8-37 堿基位置；P6為5'-TACGGCTACCTT GTTACGACTTCACCCC-3'，其序列為對應(yīng)第1479-1506 堿基位置［7］。16S rDNA PCR步驟詳見參考文獻(xiàn)［8］。用4 種限制性內(nèi)切核酸酶HinfⅠ、MspⅠ、AluⅠ和Hae Ⅲ對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化處理，Hinf I的酶切位點(diǎn)為5'-G/ATC-3'，MspI I為5'-C/CGG-3'，Alu I為5'-AG/CT-3'、Hae III為5'-GG/CC-3'，酶切體系為30 μL，37℃水浴過夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)3.0%瓊脂糖凝膠 100 V電泳4 h、UV掃描后，文件用TIF格式保存［9，10］。將4種酶切圖譜做均一化處理之后，把所得的酶切帶型轉(zhuǎn)化為“0”和“1”，即有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，以平均連鎖法（UPGMA）為基礎(chǔ)聚類，通過NTSYS.2.10軟件進(jìn)行相似性分析，最后繪制成UPGMA樹狀圖［11］。

1.2.2 16S rDNA 全序列分析 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海SanGon生物工程有限公司進(jìn)行測序。將測得序列與GenBank中相關(guān)根瘤菌已知種序列，通過MEGA5.0中的ClustalW進(jìn)行多序列比對，采用鄰接法（neighbor joining method）、Kimura twoparameter 模型通過MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自展值（Bootstrap）1 000進(jìn)行置信度檢測［12，13］。同時(shí)序列間的相似性也通過該軟件加以計(jì)算。

1.2.3 BOX-PCR 指紋圖譜分析 DNA提取同1.2.1。引物序列為BOXA1R：5'-CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G-3'，擴(kuò)增過程見參考文獻(xiàn)［14］。BOX-PCR產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠（含EB）電泳分離，電泳條件為70 V、2-3 h。電泳結(jié)束后，在凝膠成像儀中掃描凝膠，將指紋圖譜用TIFF文件保存，之后對BOX-PCR指紋的電泳圖像進(jìn)行觀察比較和分析。

2 結(jié)果

2.1 16S rDNA PCR-RFLP聚類分析

16S rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)生1 500 bp 左右大小的片段，53株供試菌株和9株已知參比菌株擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HinfⅠ、MspⅠ、AluⅠ和HaeⅢ 4種限制性內(nèi)切核酸酶酶切，得到電泳圖譜（圖1）。

通過分析電泳圖譜，得到了樹狀圖（圖2）。由圖2可知，在77.5%的相似性水平上全部供試菌株聚成5個(gè)分支。分支I為Sinorhizhobium-Rhizobium分支，分支II為Agrorhizobium-Bradyrhizobium分支，分支III是16株未知供試菌組成的分支，分支IV為Mesorhizobium分支，分支V為2株未知供試菌組成的分支。在89.8%的相似性水平上，分支I包括2個(gè)亞分支：亞分支1由CNU1008等14株供試菌組成，與Sinorhizobium meliloti LISPA1002T菌株聚在一起，涵蓋涇川、甘谷、嘉峪關(guān)、麥積山、德隆和敦煌等6個(gè)采樣地區(qū)，宿主主要是大豆、豌豆、菜豆。亞分支2包括6株未知菌，與Rhizobium leguminosarum USDA 2370T聚在一起，分離自酒泉和德隆地區(qū)，宿主為菜豆和蠶豆。分支II也包括3個(gè)亞分支：亞分支1包括CNU 1041等4株菌，分離自德隆、酒泉和涇川地區(qū)，宿主為豌豆、菜豆和大豆，與2株Agrobacterium tumefaciens IAM 13129T和 IAM 13569T聚在一起；亞分支2包括5株菌，分離自麥積山、酒泉、嘉峪關(guān)和敦煌等地區(qū)，宿主為大豆、蠶豆和豌豆，與Bradyrhizobium japonicum USDA 6T菌株聚在一起；亞分支3包括3株菌，分離自甘谷和高平地區(qū)，宿主為大豆和菜豆。分支III包括16株未知菌，分離自嘉峪關(guān)、甘谷、德隆、麥積山和敦煌地

區(qū)，宿主為蠶豆、大豆和菜豆。分支IV包括4株Mesorhizhobium的參比菌。分支V包括2株未知供試菌，分離自酒泉和高平地區(qū)，宿主為大豆和菜豆。

表1 供試菌一覽表

圖1 部分菌株16S rDNA PCR-RFLP酶切圖譜

2.2 16S rDNA全序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析

依據(jù)16S rDNA PCR-RFLP聚類結(jié)果，選取各分支代表菌株1-3株進(jìn)行16S rDNA全序列測定，并依此序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖（圖3）。圖3顯示，16S rDNA測序結(jié)果與16S rDNA PCR-RFLP的結(jié)果基本一致。菌株CNU 1001、1004、1006和1008處于分支I的Sinorhizobium亞分支，與S.fredii的相似性達(dá)到99%；菌株CNU 1009也處于分支I的亞分支1，與S.meliloti的相似性達(dá)到99%。該亞分支菌株的確切系統(tǒng)發(fā)育地位有待于DNA-DNA雜交來確定。菌株CNU 1014和1036處于分支I的Rhizobium亞分支，與R.giardinii的相似性達(dá)到99%，而該分支的另一株菌CNU 1032與R.etli的相似性為98%。因此，該亞分支的確切地位有待于DNA-DNA雜交來確定。處于分支II Agrobaterium亞分支的菌株CNU 1039和1041與A.rubi的相似性達(dá)到99%。CNU 1031和 1049處于分支II Bradyrhizobium 亞分支，與B.liaoningense 的相似性達(dá)到99%。從測序結(jié)果還可以看出（圖3），從根瘤中可以分離到非根瘤菌：處于分支II亞分支3的菌株CNU 1011、1012和1046屬于Brevibacillus，與B.reuszeri的相似性達(dá)到99%以上；處于分支III的菌株CNU 1016、1028和1037屬于Enterobacter，與E.aerogenes的相似性達(dá)到99%以上；菌株CNU 1034處于分支V，與Candidatus Roseomonas massiliae的相似性達(dá)到99%以上。

2.3 BOX-PCR指紋圖譜

分支ISinorhizobium亞分支的菌株CNU 1001、1004和1006的16S rDNA序列相似性達(dá)到100%，Rhizobium亞分支的菌株CNU 1014和1036的相似性也達(dá)到了100%（圖3）。對這些菌株進(jìn)行了BOXPCR（圖4）。從圖4可以看出，它們的BOX指紋圖譜不一樣，所以不是相同的克隆。

3 討論

3.1 分離自大豆、蠶豆、豌豆和菜豆等宿主的根

瘤菌有很大的遺傳多樣性

從甘肅河西走廊地區(qū)大豆分離到26株菌，經(jīng)16S rDNA PCR-RFLP及序列分析表明，其中9株屬于S. fredii或S.meliloti，4株屬于B.liaolingense，其余13株屬于非根瘤菌的A.rubi、Candidatus Roseomonas massiliae、B.reuszeri 和E.aerogenes。從蠶豆分離到的11株菌，2株屬于R.giardinii或R.etli，1株屬于B.liaolingense，其余8株菌屬于非根瘤菌的E. aerogenes。從豌豆分離到的6株菌，2株屬于S. fredii或S.meliloti，1株屬于R.giardinii或R.etli，1株屬于B.liaolingense，2株屬于非根瘤菌A.rubi，。從菜豆分離到的10株菌，3株屬于S. fredii或S.meliloti，3株屬于R.giardinii或R.etli，其余的4株屬于非根瘤菌的A.rubi，B.reuszeri 和E.aerogenes。可見從這些地區(qū)分離到的大豆等宿主的根瘤菌有較大的遺傳多樣性。

圖2 16S rDNA PCR-RFLP聚類圖

張紅俠等［14］采用BOX-PCR、16S rDNA PCRRFLP、16S-23S IGS PCR-RFLP 和16S rRNA 基因序列分析方法對分離自我國黃土高原地區(qū)山西、陜西、寧夏和甘肅4個(gè)省的15個(gè)地區(qū)的130 株大豆根瘤

菌及部分參比菌株進(jìn)行了遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育分析。3 種方法聚類分析結(jié)果基本一致，可將所有供試菌株分為Sinorhizobium和Bradyrhizobium兩大類群。從系統(tǒng)發(fā)育來看，供試的快生大豆根瘤菌為S. fredii，慢生大豆根瘤菌為B. japonicum和遼寧慢生B. liaoningense。從甘肅分離到的4株大豆根瘤菌都屬于S. fredii。Camacho等［15］認(rèn)為，S. fredii是中國大豆根瘤的優(yōu)勢種。本研究中大豆根瘤菌的遺傳和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與上述報(bào)道基本一致，但表現(xiàn)了更大的遺傳多樣性。

圖3 16S rDNA 全序列系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖

圖4 BOX-PCR 指紋圖譜

路敏琦［16］等采用數(shù)值分類、16S rDNA PCR -RFLP、IGS PCR -RFLP等方法對分離自我國11個(gè)省的50株蠶豆根瘤菌及11株參比菌株進(jìn)行了表型測定、遺傳型研究和16S rDNA 全序列測定。試驗(yàn)結(jié)果表明我國蠶豆根瘤菌具有極大的表型多樣性和遺傳多樣性，蠶豆根瘤菌的代表菌株均位于Rhizobium系統(tǒng)發(fā)育分支，與R. leguminosarum USDA2370的全序列相似性達(dá)99. 9%，說明蠶豆根瘤菌屬于Rhizobium，系豌豆根瘤菌的一個(gè)生物型。Tian等［17］對從江西、安徽等地的蠶豆中分離到的根瘤菌進(jìn)行了16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析和atpD和recA基因序列，表明這些菌株為屬于Rhizobium的新種，即

Rhizobium fabae。本研究中分離自蠶豆的根瘤菌2株屬于R.giardinii或R.etli，確切地位需要DNA-DNA雜交試驗(yàn)來確定，但有1株菌屬于B.liaolingense，這一結(jié)果尚屬首次報(bào)道。

從豌豆上分離的菌株只有一個(gè)種，即R. leguminosarum。楊成運(yùn)等［18］利用16S rRNA PCRRFLP、16S rRNA 基因序列分析以及16S-23S rRNA IGS PCR-RFLP 對分離自我國江蘇鹽城、浙江溫州、湖北仙桃及重慶等亞熱帶地區(qū)的42株分離自豌豆的根瘤菌進(jìn)行了群體遺傳多樣性的研究。結(jié)果表明，40株菌屬于R.leguminosarum USDA2370，2株菌與R. etli CFN42 相近。本研究與上述報(bào)道有相似之處，即從豌豆分離到的6株菌中，1株屬于R.giardinii或R.etli，但是其余5株菌中，有2株屬于S. fredii或S.meliloti，2株屬于A.rubi，1株屬于B.liaolingense，同樣顯示了很大的遺傳多樣性。

從菜豆中分離的根瘤菌分屬于Rhizobium、Sinorhizobium和Burkholderia，已確定了13個(gè)種，表現(xiàn)了極大的多樣性［19，20］。本研究中分離到的菜豆根瘤菌3株屬于S. fredii或S.meliloti，3株屬于R.giardinii或R.etli。

3.2 從甘肅河西走廊采集的根瘤中存在非共生的內(nèi)生菌

從1957年開始就發(fā)現(xiàn)根瘤中存在除根瘤菌以為的其他微生物類群［21］，Muresu 等［22］對這方面的研究進(jìn)行了總結(jié)，提出了根瘤內(nèi)生菌的概念。不同豆科植物根瘤內(nèi)的非共生內(nèi)生菌種類并不完全相同，報(bào)道比較多的是Bacillus、Pseudomonas、Enterobacter和 Klebsiella等。在菜豆根瘤中，Mhamdi 等［23］發(fā)現(xiàn)除了根瘤菌，Agrobacterium被證實(shí)通過與根瘤菌共接種，可以侵入新的根瘤，并影響它們的接瘤特性［24］。鄧振山等［25］從我國西北地區(qū)采集的苦馬豆根瘤中分離并獲得65株根瘤內(nèi)生菌，通過基于16S rDNA 全序列分析表明，這65株菌分別歸屬于3個(gè)不同的門：變形菌門（Proteobacteria，G-菌）、放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes，G+菌），并表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。在變形菌門中有4個(gè)菌株屬于α-變形菌綱（Paracoccus、Sphingomonas、Inquilinus）；11 個(gè)屬于γ-變形菌綱（Pseudomonas和Serratia）；6 個(gè)菌株分別歸屬于放線菌門中的Mycobacterium、Nocardia 和Streptomyces；有45 株分別歸屬于厚壁菌門中的Paenibacillus、Brevibacillus、Staphylococcus、Lysinibacillus 和Bacillus。

本研究從大豆、蠶豆和菜豆中分離到了非共生內(nèi)生菌。從大豆根瘤中分離到的非共生內(nèi)生菌13株，屬于A.rubi、Candidatus Roseomonas massiliae、B.reuszeri和E.aerogenes。從蠶豆根瘤中分離到的8株菌是E. aerogenes，從菜豆根瘤中分離到的4株菌屬于A.rubi、B.reuszeri 和E.aerogenes。其中，Candidatus Roseomonas massiliae目前未見報(bào)道。

根瘤內(nèi)生菌可能隨著根瘤菌的侵染而進(jìn)入植物根部，并最后出現(xiàn)在植物根瘤內(nèi)。當(dāng)內(nèi)生菌與根瘤菌共同接種時(shí)，促進(jìn)了其生長，從而也有利于植物的生長，能否也擴(kuò)大宿主范圍到非豆科植物有待于進(jìn)一步研究［25］。

4 結(jié)論

16S rDNA PCR-RFLP及16S rDNA全 序 列 分析表明，其中9株屬于S. fredii或S.meliloti，4株屬于B.liaolingense，其余13株屬于非根瘤菌的A.rubi、Candidatus Roseomonas massiliae、B.reuszeri和E.aerogenes。從蠶豆分離到的11株菌，2株屬于R.giardinii或R.etli，1株屬于B.liaolingense，其余8株菌屬于非根瘤菌的E. aerogenes。從大豆分離到的6株菌，2株屬于S. fredii或S.meliloti，1株屬于R.giardinii或R.etli， 1株屬于B.liaolingense，2株屬于非根瘤菌A.rubi，。從菜豆分離到的10株菌，3株屬于S. fredii或S.meliloti，3株屬于R.giardinii或R.etli，其余的4株屬于非根瘤菌的A.rubi，B.reuszeri和E.aerogenes，顯示豐富的遺傳多樣性。

BOX-PCR指紋圖譜研究表明，CNU1001、CNU1004和CNU1006三者并非同一菌株的克??；CNU1036和CNU1014確定為賈氏根瘤菌（R.giardinii）的兩個(gè)不同的菌株。

［1］楊雪穎, 張執(zhí)欣, 楊亞珍, 等.甘草根瘤菌的16S rDNA 全序列測定及系統(tǒng)進(jìn)化分析［J］. 西北植物學(xué)報(bào), 2006, 26（4）：707-711.

［2］Gaunt MW, Turner SL, Rigottier GL, et al. Phylogenies of atpD and recA support the small subunit rRNA-based classification of rhizobia［J］. Int J Syst Evol Microbiol, 2001, 6（51）：2037-2048.

［3］Vandamme P, Pot B, Gillis M, et al. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics［J］. Microbiological Reviews, 1996, 2（60）：407-438.

［4］Wei GH, Gong MF, Lv SQ. Rhizobia in pamirs plateau of China：Investigation of symbiotic resources with leguminous plants［J］. Acta Bot Boreal, 2005, 25（8）：1618-1622.

［5］林萬明.分析微生物學(xué)專輯［M］.北京：科學(xué)出版社, 1988：88-89.

［6］Chen WP, Kuo TT. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA［J］. Nucleic Acids Research, 1993, 21（9）：2260.

［7］Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, et al. 16S Ribosomal DNA amplification for phylogenetic study［J］. J Bacteriol, 1991, 173（2）：697-703.

［8］van Berkum P, Beyene D, Eardly BD. Phylogenetic relationships among Rhizobium species nodulating the common bean（Phaseolus vulgaris L.）［J］. Int J Syst Evol Microbiol, 1996, 46（1）：240-244.

［9］Laguerre G, Allard M, Revory F, et al. Rapid identification of rhizobia by restriction fragment length polymorphism analysis of PCR-amplified 16S rRNA genes［J］. Appl Environ Microbiol, 1994, 60（1）：56-63.

［10］李俊, 樊蕙, 李力, 等.慢生根瘤菌交叉結(jié)瘤及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2003, 9（1）：59-62.

［11］畢江濤, 賀達(dá)漢, 韋革宏, 等.沙冬青根瘤菌遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育分析［J］. 西北植物學(xué)報(bào), 2009, 29（4）：0695-0703.

［13］Jukes TH, Cantor CR. Evolution of protein molecule［M］//Munro HN. Mammalian protein metabolism. New York：Academic Press, 1969：21-132.

［14］張紅俠, 馮瑞華, 李俊. 黃土高原地區(qū)大豆根瘤菌的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育［J］.微生物學(xué)報(bào), 2010, 50（11）：1466 -1473.

［15］Camacho C, Santanaria C, Temprano F, et al. Soils of the China Hubei province show a very high diversity of S.fredii strains［J］. Sys Apl Microbiol, 2002, 25：592-602.

［16］路敏琦, 李俊, 姜昕, 等. 我國蠶豆根瘤菌的多樣性和系統(tǒng)發(fā)育研究［J］. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2007, 13（1）：73-77.

［17］Tian CF, Wang ET, Wu LJ, et al. Rhizobium fabae sp. nov., a bacterium that nodulates Vicia faba［J］. Int J Syst Evol Microbiol, 2008, 58（12）：2871-2875.

［18］楊成運(yùn), 楊江科, 李友國, 等. 我國亞熱帶地區(qū)豌豆根瘤菌遺傳多樣性的研究［J］.中國科學(xué) C 輯：生命科學(xué), 2008, 38（8）：774 -782.

［19］Mnasri B, Saidi S, Chihaoui S, et al. Sinorhizobium americanum symbiovar mediterranense is a predominant symbiont that nodulates and fixes nitrogen with common bean（Phaseolus vulgaris L.）in a Northern Tunisian field［J］. Syst Appl Microbiol, 2012, 35：263-269.

［20］Aserse AA, R?s?nen LA, Assefa F, et al. Phylogeny and genetic diversity of native rhizobia nodulating common bean（Phaseolus vulgaris L.）in Ethiopia［J］. Syst Appl Microbiol, 2012, 35：120-131.

［21］Philipson MN, Blair ID. Bacteria in clover root tissue［J］. Can J Microbiol, 1957, 3（2）：125-129.

［22］Muresu R, Polone E, Sulas L, et al. Coexistence of predominantly nonculturable rhizobia with diverse, endophytic bacterial taxa within nodules of wild legumes［J］. FEMS Microbiology Ecology Ecology, 2008, 63（3）：383-400.

［23］Mhamdi R, Mrabet M, Laguerre G, et al. Colonization of Phaseolus vulgaris nodules by Agrobacterium-like strains［J］. Can J Microbiol, 2005, 51（2）：105-111.

［24］Mrabet M, Mnasri B, Romdhane S, et al. Agrobacterium strains isolated from root nodules of common bean specifically reduce nodulation by Rhizobium gallicum［J］. FEMS Microbiol Ecol, 2006, 56（2）：304-309.

［25］鄧振山, 李軍. 豆科植物根瘤中非共生的內(nèi)生菌遺傳多樣性研究進(jìn)展［J］. 微生物學(xué)雜志, 2012, 32（4）：63-68.

（責(zé)任編輯 李楠）

Diversity and Phylogeny of Rhizobium Isolated from Root Nodules of Legumes in Jiuquan and Other Regions，Gansu

Li Zheng Shan Huihui Qi Yalin Liu Lei Han Suzhen
（College of Life Science of Capital Normal University，Beijing 100048）

The 16S rDNA PCR-RFLP and 16S rDNA sequence analysis were used on genetic and phylogeny of 53 strains isolated from Glycine max, Vicia faba, Pisum sativum and Phaseolus vulgaris of Jiuquan and other regions, Gansu and 9 known strains. Results of 16S rDNA PCR-RFLP indicated that all isolates included 9

trains were clustered into 5 branches at 77.5% similarity. Branch I was Sinorhizhobium-Rhizobium, branch II Agrorhizobium-Bradyrhizobium, branch III unknown bacteria branch, branch IV Mesorhizobium, and branch V also unknown branch. Branch I included 2 sub branches at 89.8% similarity：Sub branch 1 included strains CNU1008 and 14 strains witch clustered with Sinorhizobium meliloti LISPA1002T, Subbranch 2 included 6 strains which clustered with Rhizobium leguminosarum USDA 2370T. Branch II included 3 sub branches：Sub branch 1 included CNU 1041 and other 3 strains witch clustered with 2 strains of Agrobacterium tumefaciens IAM 13129Tand IAM 13569Ttogether, sub branch 2 included 5 strains which clustered with Bradyrhizobium japonicum USDA 6T, sub branch 3 included 3 unknown strains. Representative strains were selected in the analysis of 16S rDNA sequencing, and the results show that 16S rDNA PCR-RFLP and16S rDNA sequencing analysis were in good agreement. Strains of Sinorhizobium sub branch of branch I were clustered with S.fredii and S.meliloti at 99% similarity, and their exact system status should be determined by DNA-DNA hybridization. Strains of Rhizobium sub branch of branch I were clustered with R.giardinii at 99% similarity and with R.etli at 98% similarity. So the exact position of

Rhizobia 16S rDNA PCR-RFLP 16S rDNA sequencing

2014-04-10

李正，男，碩士研究生，研究方向：細(xì)菌分類；E-mail：lizheng2014@gmail.com

韓素貞，女，博士，副教授，研究方向：細(xì)菌分類，E-mail：hansuzhen@vip.sina.com

the sub branch waited for DNA-DNA hybridization to determine. Strains of Agrobacterium sub branch of the branch II clustered with A.rubi at the similarity of 99%. Strains of Bradyrhizobium sub branch of the branch II were clustered with B.liaoningense at the similarity of 99%.