,,,,,,*

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003;2.日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院,山東日照 267826)

鈣是維持人體健康的重要礦物元素,在骨骼與牙齒的形成、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、肌肉組成和心臟搏動調(diào)節(jié)等生理活動中發(fā)揮著重要作用。鈣主要通過飲食攝入,尤其以牛奶或奶酪制品含鈣量較高。食物中的植酸、草酸、飽和脂肪酸、膳食纖維等物質(zhì)易與鈣結(jié)合形成難溶物,不利于鈣的吸收。缺鈣可以導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、佝僂癥等多種疾病的發(fā)生。

我國水產(chǎn)品產(chǎn)量位居世界第一,其中淡水魚產(chǎn)量達到50%。目前全球水產(chǎn)品加工業(yè)每年約產(chǎn)生30%的副產(chǎn)物[1],其中很大的一部分是魚卵。淡水魚肌肉只占體重的30%～50%,副產(chǎn)物比例較大,尤其是卵巢部分,在繁殖季節(jié)最大可達體重10%～25.81%。水產(chǎn)加工副產(chǎn)物已經(jīng)有大量的利用研究,如從魚皮、魚鱗中提取膠原[2],蝦蟹殼中提取殼聚糖[3],從魚類精巢中提取具有抑菌保鮮和生理活性等功能的魚精蛋白[4],而關(guān)于魚卵的利用研究則較少。

大量研究表明氨基酸或肽鈣復(fù)合物具有抑制鈣在腸道中沉淀,促進腸道對鈣的吸收,增強鈣生物利用率的功能。如Tsuchita[5]等報道稱CPP-Ca能有效抑制老年去卵巢大鼠的骨質(zhì)流失,Jung[6]等報道稱魚骨肽鈣復(fù)合物能顯著增強去卵巢大鼠的鈣生物利用率,增強股骨鈣含量、骨重、骨密度和骨強度,Choi[7]等研究表明卵黃磷酸肽鈣復(fù)合物能有效促進大鼠的鈣吸收和骨鈣沉積,增強骨密度,韓櫻[8]等研究表明蛋清肽鈣復(fù)合物能顯著增加大鼠股骨直徑、重量、骨鈣含量及骨密度,陳瑞儀[9]等證實氨基酸螯合鈣能增加大鼠骨密度。

本文首次對魚卵磷酸肽(EPP)的促鈣吸收作用進行研究,并與碳酸鈣、酪蛋白磷酸肽-鈣復(fù)合物(CPP-Ca)進行比較,為魚卵用于補鈣產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗動物SPF級SD雄性大鼠 山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司,合格證號:SCXK(魯)2008-002,體重80～90g;飼養(yǎng)房環(huán)境參數(shù):溫度(20±2)℃,濕度為60%±5%,12h晝夜交替。

氯仿、甲醇、硝酸、高氯酸、水合氯醛 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;酪蛋白磷酸肽CPP 青島秀佰銳生物器材有限公司;Lunar Prodigy雙能X線骨密度儀 美國GE公司;Zwick/Z005型電子萬能實驗機 德國Zwick公司;ACA-100 型電子天平 美國Denver儀器公司;AA320CRT型原子吸收分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;ADVIA 2400全自動生化分析儀 日本Siemens公司;TGL-16G-A高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;AL-104電子精密天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;游標卡尺 桂林廣陸數(shù)字測控有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鯉魚卵磷酸肽-鈣復(fù)合物(EPP-Ca)的制備 參照前期實驗結(jié)果[10],脫脂魚卵粉用胰蛋白酶酶解(胰蛋白酶3%,底物濃度2.5%,pH8.0,49℃,12h)后,100℃ 加熱5min 滅酶,于4℃、10000r/min條件下離心20min后取上清液過0.45μm微孔濾膜,濾液經(jīng)噴霧干燥即得魚卵磷酸肽(EPP)。將EPP與氯化鈣進行鈣結(jié)合反應(yīng)(蛋白與鈣鹽質(zhì)量比6∶1,pH6.0,50℃,30min)后,離心除去沉淀,上清液加入與等體積的無水乙醇,于10000r/min、4℃條件下離心5min收集沉淀,即為EPP-Ca粗品。EPP-Ca粗品用無水乙醇多次洗滌,除去未結(jié)合的蛋白和游離鈣,用二硫腙和茚三酮檢測濾液顏色(二硫腙檢測顯示紅色,表明含有游離鈣離子,綠色則無;茚三酮檢測顯示藍紫色,表明存在未結(jié)合的蛋白,不顯色則無),最終干燥得到EPP-Ca(蛋白含量87.2%,鈣含量9.6%)。酪蛋白磷酸肽-鈣復(fù)合物(CPP-Ca)的制備參照上述方法。

1.2.2 自制缺鈣飼料和普通飼料 普通飼料和缺鈣飼料參考AIN-93G方法配制(表1)。普通飼料鈣含量為5000mg/kg飼料,低鈣飼料鈣含量為1000mg/kg飼料。

1.2.3 動物飼喂方式 大鼠適應(yīng)性飼喂1周后,將65只SD大鼠稱重、隨機分成5組,每組13只(表2)。正常對照組一直飼喂普通飼料,低鈣組一直飼喂低鈣飼料;其余3組飼喂低鈣飼料四周,在繼續(xù)飼喂低鈣飼料基礎(chǔ)上,按照鈣200mg/kg體重的劑量,分別灌胃碳酸鈣、FSP-Ca和CPP-Ca四周。大鼠用不銹鋼鼠籠喂養(yǎng),鼠籠每周清洗、消毒,實驗期間大鼠自由飲用去離子水。每周稱一次體重,增重率為大鼠灌胃前后體重增長率。

1.2.4 血液生化指標測定 實驗結(jié)束后,大鼠腹腔注射水合氯醛(0.3g·kg-1)將其麻醉,腹主動脈取血4mL,低溫靜止20min后,離心(4500r/min,10min,4℃)取血清,置全自動生化分析儀中檢測血清中鈣、磷和堿性磷酸酶含量。

表1 大鼠飼料配方Table 1 Diet formulated for rats

表2 大鼠分組及飼喂方式Table 2 Groups of rats and its feeding ways

1.2.5 鈣表觀吸收率 實驗結(jié)束前三天將各組大鼠分別置代謝籠中,收集糞并將其于95℃烤箱中干燥,取出后置干燥器中冷卻,稱量干重后研成粉末,濕法消化后采用火焰原子吸收法測定其中鈣含量。

1.2.6 大鼠股骨指標測定 將大鼠左側(cè)股骨剝離干凈,用電子天平稱濕重,游標卡尺測定骨長度。用氯仿-甲醇(2∶1)混合液浸泡24h脫脂,烤箱95℃過夜后干法灰化,稱重?；曳钟没鹧嬖游辗y鈣含量。取大鼠右側(cè)股骨,置于雙能X線骨密度儀掃描臺上,測定股骨中點密度,再置于電子萬能實驗機上進行測試,設(shè)定跨距20mm,加載速度1mm/min,測定最大載荷(ML)、彈性載荷和剛度。

2 結(jié)果與分析

2.1 EPP-Ca對大鼠生長及鈣吸收的影響

表3 EPP-Ca對大鼠體重和鈣吸收率的影響Table 3 Effect of EPP-Ca on body weight and calcium absorption ratio of rats

注:各列數(shù)據(jù)中上標不同的字母說明存在顯著性差異,p<0.05。表4～表6同。

表5 EPP-Ca對股骨長度、重量、密度及骨鈣的影響Table 5 Effects of EPP-Ca on femurs length,weight,bone mineral density and Ca content

由表3可知,缺鈣模型組的增重率僅為16.52%,顯著低于其余各組,說明缺鈣已經(jīng)導(dǎo)致大鼠營養(yǎng)不良,體重增長緩慢。三種補鈣方式均能顯著增加大鼠增重率,改善前期由于缺鈣導(dǎo)致的營養(yǎng)不良狀態(tài)。雖然三種補鈣方式增重率不存在顯著性差異,但EPP-Ca組和CPP-Ca組的增重率分別為25.53%和25.04%,更接近正常對照組的26.72%,而無機鈣組的增重率為23.55%,顯著低于正常對照組。除缺鈣模型組的鈣攝入量控制在10.13mg/d的低水平外,其余各組的鈣攝入量均達到50mg/d且無顯著性差異,使得各組可以在相同鈣攝入水平上比較吸收率。EPP-Ca組和CPP-Ca組的糞鈣分別為17.82%和17.06%,均顯著低于正常對照組,而吸收率分別為65.28%和65.89%,均顯著高于正常對照組,說明大鼠在缺鈣狀態(tài)下鈣的吸收率將高于正常水平,以盡快改善體內(nèi)鈣不足的生理狀況,這種現(xiàn)象在缺鈣模型組得到有力證實。缺鈣模型組的鈣吸收率高達84.32%。何麗[11]、呂瑩[12]的研究也表明大鼠在低鈣攝入條件下,鈣吸收率可達80%～90%。但這是由于鈣攝入嚴重不足引起的,這種情況下的高吸收率對改善機體營養(yǎng)狀況是沒有意義的。EPP-Ca和CPP-Ca的補鈣效果要顯著優(yōu)于無機鈣,二者的鈣吸收率是無機鈣的2倍左右。兩種肽鈣復(fù)合物在促進大鼠增重率、降低糞鈣和增加鈣吸收率方面的作用均不存在顯著性差異。

2.2 EPP-Ca對血液指標的影響

當機體內(nèi)鈣充足時,腸道吸收的鈣通過血液在骨骼沉積,促進骨骼生長,增強骨密度和骨強度,血鈣維持在正常水平。當機體缺鈣,導(dǎo)致血鈣降低,甲狀旁腺激素(PTH)會動員骨鈣釋放入血,維持血鈣穩(wěn)定,同時骨中成骨細胞異常活躍,合成大量血清堿性磷酸酶(ALP)釋放進入血液。由表4可知,缺鈣模型組的血清鈣僅為2.15mmol/L,顯著低于其它各組,說明缺鈣模型造模是成功的。雖然三種補鈣方式均能有效維持正常血鈣水平,但EPP-Ca和CPP-Ca的血鈣水平分別達到2.58mmol/L和2.62mmol/L,顯著高于無機鈣,這與鈣吸收率的結(jié)果相吻合,說明肽鈣復(fù)合物態(tài)鈣比無機態(tài)鈣更能促進大鼠體內(nèi)鈣的吸收。各組之間血清磷不存在顯著性差異,說明機體補充鈣劑對血清磷無明顯影響。缺鈣模型組的ALP含量高達240.75U/L,顯著高于其余4組,說明缺鈣導(dǎo)致大鼠機體鈣代謝出現(xiàn)了異常,而通過補充鈣劑能有效維持機體對鈣的需求,使血清堿性磷酸酶含量維持穩(wěn)定。

表4 EPP-Ca對大鼠血鈣、磷和堿性磷酸酶含量Table 4 Effect of EPP-Ca on Serum Ca,P and ALP of rats

2.3 EPP-Ca對大鼠骨骼生長的影響

由表5可知,各組的骨長度之間不存在顯著性差異,說明補鈣對股骨長度沒有明顯影響。對于缺鈣大鼠來說,補鈣能顯著增加骨重量、骨密度和骨鈣含量(p<0.05)。就骨重量來說,EPP-Ca組高達877.31mg,顯著高于缺鈣模型組,而三種補鈣方式間不存在顯著性差異,均能達到正常對照組的骨重量水平。就骨密度和骨鈣含量而言,EPP-Ca組分別為0.22g/cm2和254.75mg/g,顯著高于缺鈣模型組和無機鈣組,與CPP-Ca組相當,說明肽鈣復(fù)合物能顯著促進大鼠體內(nèi)鈣在骨中的沉積,使大鼠骨密度和骨鈣含量迅速恢復(fù)到正常水平,且效果要優(yōu)于無機鈣,這與鈣吸收率的結(jié)果相吻合。

骨生物力學(xué)是研究大鼠骨骼在外力作用下的力學(xué)特征和受力之后的生物學(xué)效應(yīng),目的是了解骨骼力學(xué)強度變化及在骨骼負荷時發(fā)生骨折的可能性。大鼠股骨生物力學(xué)指標也表明,EPP-Ca能顯著增加缺鈣大鼠股骨的最大載荷、彈性載荷和剛度,效果要顯著優(yōu)于無機鈣,而且其彈性載荷和剛度顯著高于正常對照組。

表6 大鼠股骨生物力學(xué)指標Table 6 Femur biomechanical indexes of rats

3 討論

缺鈣是全球性的營養(yǎng)問題,膳食結(jié)構(gòu)不當以及特殊的生理階段(如青少年、絕經(jīng)后婦女、老年等)均會引起人體缺鈣[13-14]。體內(nèi)鈣處于平衡狀態(tài),99%的鈣存在于骨骼當中,其余1%處于牙齒、軟骨組織、血液以及管外漿液中[15]。有效的鈣制劑需要滿足兩個方面的要求,即高吸收率和高利用率[16]。

青少年體重增長率是衡量機體營養(yǎng)狀況的綜合指標,營養(yǎng)不良往往導(dǎo)致生長較緩。本實驗中EPP-Ca能有效促進大鼠生長,增重率達25.53%,效果優(yōu)于無機鈣。

鈣的吸收主要發(fā)生在小腸,小腸吸收的鈣占總吸收鈣的90%[17]。小腸近端主要以主動方式吸收,而遠端以被動方式吸收。人體對鈣的吸收率一般為30%～80%。當攝入鈣不足時,鈣主要在小腸近端被主動吸收,而當鈣攝入充足時,鈣主要在小腸遠端被動擴散吸收[18]。小腸遠端的堿性環(huán)境會導(dǎo)致鈣聚集沉淀而無法被吸收。研究表明,CPP具有阻止鈣在小腸遠端中沉淀,從而促進鈣的吸收[19]。本實驗中EPP-Ca的吸收率均顯著高于無機鈣,說明EPP可能也是通過抑制鈣在小腸遠端的沉淀而促進鈣的吸收。

長時間的缺鈣會使骨鈣得不到有效補充,導(dǎo)致骨鈣丟失、骨密度下降、骨強度下降等,嚴重時導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥、佝僂病。本實驗中EPP-Ca能維持正常的血鈣水平,顯著增加骨重、骨鈣含量、骨密度和骨強度,顯著降低血清ALP含量,而且效果顯著優(yōu)于無機鈣。

4 結(jié)論

本文通過缺鈣大鼠模型動物實驗證明EPP-Ca能顯著促進大鼠增重、顯著增加大鼠鈣吸收率、血清鈣水平、股骨重量、骨密度、骨鈣含量和生物力學(xué)指標、顯著降低血清堿性磷酸酶含量,而且補鈣效果優(yōu)于無機鈣,與CPP-Ca效果相當。EPP-Ca有望成為新型的補鈣制劑。

[1]Jung WK,Park PJ,Byun HG,etal. Preparation of hoki(Johnius belengerii)bone oligophosphopeptide with a high affinity to calcium by carnivorous intestine crude proteinase[J]. Food Chem,2005,91:333-340.

[2]Kim SK,Byun HG,Lee EH. Optimum extraction conditions of gelatin from fish skins and its physical properties[J]. J Korean Indus Eng Chem,1994,5:547-559.

[3]Jeon YJ,Kim SK. Continuous production of chitooligosaccharides using a dual reactor system[J]. Process Biochem,2000,35:623-632.

[4]Falch E,Rustadb T,Jonsdottir R. Geographical and seasonal differences in lipid composition and relative weight of by-products from gadiform species[J]. J Food Compos Anal,2006,19:727-736.

[5]Tsuchita H,Goto T,Shimizu T,etal. Dietary casein phosphopeptides prevent bone loss in aged ovariectomized rats[J].J Nutr,1996,126:86-93.

[6]Jung WK,Lee BJ,Kim SK. Fish-bone peptide increases calcium solubility and bioavailability in ovariectomised rats[J]. British Journal of Nurtrition,2006,95:124-128.

[7]Choi I,Jung C,Choi H. Effectiveness of phosvitin peptides on enhancing bioavailabilityof calcium and its accumulation in bones[J]. Food Chemsitry,2005,93:577-583.

[8]韓櫻,何慧,趙寧寧,等. 蛋清肽-鈣配合物體內(nèi)促鈣吸收作用研究[J]. 食品科學(xué),2012,33(11):262-265.

[9]陳瑞儀,譚劍斌,周軼琳,等. 氨基酸螯合鈣增加骨密度作用的實驗研究[J]. 氨基酸和生物資源,2011,33(1):60-62.

[10]Li YH,Huang H. Enzymatic preparation of carp roes’ hydrolysate with Ca-binding capacity[J]. Advanced Materials Research,2012,554-556:1309-1317.

[11]何麗,薛安娜,付萍. 多種鈣劑不同鈣含量對大鼠鈣吸收及骨密度的影響[J]. 衛(wèi)生研究,2002,31(4):258-260.

[12]呂瑩. 大豆肽結(jié)合鈣的機制及其促進機體鈣吸收和增強骨質(zhì)量的生物學(xué)效應(yīng)[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[13]Nordin BEC. Calcium and osteoporosis[J]. Nutrition,1997,13:664-686.

[14]Kerstetter JE,Brien KOO,Insogna KL. Dietary protein affects intestinal calcium adsorption[J]. Am J Clin Nutr,1998,68:859-865.

[15]Straub DA,Ranch C. Calcium supplement in clinical practice:A review of forms,doses,and indications[J]. Nutr Clin Practice,2007,22:286-296.

[16]Perez AV,Picotto G,Carpentieri AR. Minireview on regulation of intestinal calcium absorption[J]. Digestion,2008,77:22-34.

[17]Bronner F. Recent developments in intestinal calcium absorption[J]. Nutrition Reviews,2008,67(2):109-113.

[18]Hoenderop JGJ,Nilius B,Bindels RJM. Calcium absorption across epithelia[J]. Physiol Rev,2005,85:373-422.

[19]Sato R,Noguchi T,Naito H. Casein phosphopeptide(CPP)enhances calcium absorption from the ligated segment of rat small intestine[J]. Journal of Nutritional Science and Vitaminology,1986,32:67-76.

[20]Mykkanen HM,Wasserman RH. Enhanced absorption of calcium by casein phosphopeptides in rachitic and normal chicks[J]. Journal of Nutrition,1980,10:2141-2148.