郭婷婷，婁永江

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院, 浙江 寧波 315211)

布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii，俗稱油藻)，是一種適應(yīng)性較強(qiáng)的單細(xì)胞綠色微藻，大小在30～500 μm左右[1,2]。布朗葡萄藻富含胞外多糖、維生素和多不飽和脂肪酸等物質(zhì)，有較強(qiáng)的產(chǎn)烴能力，其產(chǎn)烴量最高可達(dá)細(xì)胞干重的86%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它微生物的產(chǎn)烴量(幾乎都低于1%)，在食品生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用較為廣泛，是近年在保健食品生產(chǎn)及魚、蝦育苗等領(lǐng)域應(yīng)用較佳的經(jīng)濟(jì)藻類[3-7]。布朗葡萄藻作為二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等高度不飽和脂肪酸和可再生、無毒的生物質(zhì)液體燃料的新來源日益受到國內(nèi)外科研工作者的重視[8,9]。目前由于布朗葡萄藻采收困難，導(dǎo)致其生物質(zhì)采收費(fèi)用要遠(yuǎn)大于其養(yǎng)殖的費(fèi)用[7,10]，已嚴(yán)重阻礙布朗葡萄藻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此研究布朗葡萄藻的沉降及采收具有較大的價(jià)值。無機(jī)絮凝劑絮凝沉降法具有高效、易控制、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，在微藻的采收上應(yīng)用廣泛。林喆、黃振英[7,10]等研究表明通過無機(jī)絮凝劑可以在保持藻體的活性下使藻類沉淀，從而達(dá)到濃縮的效果，便于采收。而關(guān)于無機(jī)絮凝劑對布朗葡萄藻的絮凝效應(yīng)的研究未見報(bào)道。為此，本文采用單因子試驗(yàn)方法，研究了不同濃度的硫酸鋁、硫酸鋁銨、硫酸鋁鉀、硫酸鎂、硫酸鐵、氯化鐵對布朗葡萄藻絮凝效果的影響，旨在確定其絮凝最佳無機(jī)絮凝劑及濃度，以期為布朗葡萄藻的采收提供理論依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用布朗葡萄藻由寧波大學(xué)生物餌料培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供。用于微藻培養(yǎng)的海水均經(jīng)脫脂棉過濾、煮沸消毒，采用MAV[11]培養(yǎng)液。培養(yǎng)條件：溫度(25±1)℃，自然光照，不充氣培養(yǎng)15～30 d。

1.2 方法

1.2.1 布朗葡萄藻測定波長確定

采用光譜掃描法[12, 13]。選取同一批不同細(xì)胞密度的藻液，以MAV培養(yǎng)液作為空白對照，在620～700 nm間每隔5 nm進(jìn)行光譜掃描，繪制吸收曲線，選擇吸光值較高且平穩(wěn)的波長為其測定波長。

1.2.2 布朗葡萄藻細(xì)胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用光密度法[12, 13]，以細(xì)胞密度表征布朗葡萄藻的生物量。配制不同細(xì)胞密度的布朗葡萄藻藻液，采用血球計(jì)數(shù)板法[14]測定布朗葡萄藻藻液的細(xì)胞密度。最佳測定波長下測定不同細(xì)胞密度藻液的吸光值，繪制吸光值與細(xì)胞密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 無機(jī)試劑絮凝效應(yīng)測定

以沉降高度和沉降率表征絮凝效應(yīng)，設(shè)不同濃度的硫酸鋁、硫酸鋁銨、硫酸鋁鉀、硫酸鎂、氯化鐵和硫酸鐵溶液。藻液pH值為8的條件下，將6種無機(jī)絮凝劑分別添加到75 mL(容器半徑為1.3 cm，最高高度為14.4 cm)布朗葡萄藻藻液中進(jìn)行絮凝試驗(yàn)。藻液初始細(xì)胞密度為ρ0(萬個(gè)/mL)，初始藻液高度h0(cm)。在10、25、40、60、120 min時(shí)測量沉降后下層藻液高度h1(cm)，計(jì)算沉降高度h沉降(cm)；在40、60、120 min時(shí)記錄上清藻液OD680，根據(jù)1.2.2所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清藻液細(xì)胞密度ρ1(萬個(gè)/mL)，計(jì)算其沉降率P沉降(%)；沉降高度和沉降率計(jì)算公式如下：

h沉降=h0-h1

(1)

P沉降=(ρ0-ρ1)/ρ0×100

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 布朗葡萄藻測定波長確定

圖1為不同細(xì)胞密度布朗葡萄藻藻液的光譜掃描結(jié)果。在試驗(yàn)設(shè)定的不同波長中，所測得的不同細(xì)胞密度的藻液均在680 nm±5 nm處存在相對較大且平穩(wěn)吸收峰，與黃美玲[12]等報(bào)告的小球藻及沈萍萍[13]等報(bào)告的15種微藻的最佳測定波長相同，最佳測定波長與其色素種類組成及含量有關(guān)，說明布朗葡萄藻與大部分微藻含有相似的色素。為此，以O(shè)D680表征布朗葡萄藻的吸光值。

圖1 不同細(xì)胞密度布朗葡萄藻光譜掃描圖

2.2 680 nm條件下吸光值與細(xì)胞密度之間的關(guān)系

同一批不同細(xì)胞密度的布朗葡萄藻藻液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法(n=5)測定細(xì)胞密度，采用光密度法，繪制吸光值與藻細(xì)胞密度之間的吸收曲線。圖2表明，在680 nm的波長下，吸光值與細(xì)胞密度線性相關(guān)度達(dá)R2=0.9918，可用OD680表征布朗葡萄藻的細(xì)胞密度。

圖2 680 nm波長下藻液吸光值與細(xì)胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 無機(jī)絮凝劑絮凝效應(yīng)

2.3.1 絮凝效應(yīng)的表征及絮凝時(shí)間

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉降高度反映沉降后布朗葡萄藻藻液含水量，即富集度，沉降高度越高，富集度越好；沉降率反應(yīng)沉降后布朗葡萄藻的得率，沉降率越高，得率越高；因此以沉降高度和沉降率綜合表征絮凝效應(yīng)。同時(shí)布朗葡萄藻經(jīng)6種無機(jī)絮凝劑絮凝處理，60 min后沉降高度和沉降率趨于穩(wěn)定，以60 min絮凝處理后的沉降高度、沉降率表征6種無機(jī)試劑對布朗葡萄藻的絮凝效應(yīng)。

2.3.2 鋁(Ⅲ)鹽絮凝效應(yīng)

從圖3(a)中可以看出，隨著硫酸鋁添加量的增加，沉降高度呈現(xiàn)上升趨勢，但在60 min后并無顯著差異(P>0.05)。藻液在絮凝60 min后，不同濃度的硫酸鋁的沉降高度在11.88～12.24 cm之間(P>0.05)；從圖3(b)中可以看出，硫酸鋁對藻液的沉降率在絮凝60 min后趨于穩(wěn)定，不同濃度的硫酸鋁對藻液的沉降率有顯著差異(P<0.05)，當(dāng)添加量為1.1 g/L時(shí)出現(xiàn)最大值為91.2%。

從圖4(a)絮凝結(jié)果可以看出，硫酸鋁銨的添加量在0.5～0.7 g/L時(shí)，不同濃度的硫酸鋁銨對沉降高度的影響并不顯著(P>0.05)。沉降60 min藻液穩(wěn)定后，硫酸鋁銨的添加量為1.1 g/L時(shí)，沉降高度出現(xiàn)最大值為12.42 cm。但是，當(dāng)硫酸鋁銨濃度大于0.7 g/L時(shí)，藻體部分死亡變白，硫酸鋁銨濃度大于1.2 g/L時(shí)，藻體全部死亡。因此硫酸鋁銨的最適添加量應(yīng)為0.5 g/L，絮凝60 min后沉降高度為12.06 cm，沉降率為83.2%(圖4b)。

不同濃度的硫酸鋁鉀對藻液的沉降高度及沉降率有顯著差異(P<0.05)，藻液的沉降高度和沉降率隨硫酸鋁鉀濃度的增加呈現(xiàn)上升趨勢(圖5)。從圖中可以看出，沉降60 min后，沉降高度與沉降率趨于穩(wěn)定，此時(shí)藻液的沉降高度最大為12.06 cm(圖5a)，沉降率為93.5%(圖5b)。硫酸鋁鉀濃度大于0.5 g/L時(shí)，藻體部分死亡變白，因此硫酸鋁鉀的添加量應(yīng)小于0.5 g/L。在添加量為0.45 g/L，沉降60 min后，藻液的沉降高度為10.08 cm，沉降率為93.5%。

3種鋁(Ⅲ)鹽對布朗葡萄藻的絮凝效應(yīng)不同，是由于在pH值為8條件下3種鹽中的鋁離子強(qiáng)度的不同，離子強(qiáng)度越強(qiáng)，鋁離子對細(xì)胞壁上多糖的絡(luò)合力就越強(qiáng)，吸附效率越高，絮凝效應(yīng)越好[15,16]；高濃度硫酸鋁銨對布朗葡萄藻之所以有致死作用，主要是銨離子對藻體有脅迫作用，抑制叢粒藻烯的合成，后期造成不可逆的毒害作用[17]；而硫酸鋁鉀其本身有一定毒性，需在食品和藻類中慎加，對布朗葡萄藻藻體的細(xì)胞壁有不可逆的毒害作用，易造成藻體死亡。

圖3 不同濃度硫酸鋁對布朗葡萄藻的絮凝效應(yīng)

圖4 不同濃度硫酸鋁銨對布朗葡萄藻的絮凝效應(yīng)

圖5 不同濃度硫酸鋁鉀對布朗葡萄藻的絮凝效應(yīng)

2.3.3 鎂(Ⅱ)鹽絮凝效應(yīng)

從圖6(a)中可以得出，隨著硫酸鎂添加量的增加，藻液沉降高度呈顯著的上升趨勢(P<0.05)，在絮凝時(shí)間高于60 min后，沉降高度趨于穩(wěn)定。對于沉降率(圖6b)，有相同的趨勢。但是，硫酸鎂濃度≥1.0 g/L時(shí)，藻體部分死亡變白，硫酸鎂濃度≥1.3 g/L時(shí)，藻體全部死亡。因此，硫酸鎂對藻液絮凝作用的最適添加量為0.8～0.9 g/L，沉降高度和沉降率分別為10.80 cm和81.0%。

高濃度的硫酸鎂溶液之所以對布朗葡萄藻有致死作用，主要是因?yàn)殒V離子對布朗葡萄藻有脅迫作用[18]，易引起布朗葡萄藻死亡變白。

圖6 不同濃度硫酸鎂對布朗葡萄藻的絮凝效應(yīng)

2.3.4 鐵(Ⅲ)鹽絮凝效應(yīng)

以硫酸鐵為絮凝劑對布朗葡萄藻的絮凝作用見圖7。從圖7(a)中可以看出，隨著添加量的增大，藻液的沉降高度呈顯著變化(P<0.05)。60 min后，硫酸鐵的添加量為1.2 g/L時(shí)，有最高的沉降高度為10.8 cm，此時(shí)藻液的沉降率為47.9%(圖7b)；對于藻液的沉降率，在整個(gè)絮凝過程中隨硫酸鐵的添加量的增加呈顯著的上升趨勢(P<0.05)，硫酸鐵的添加量為1.4 g/L時(shí)，其最大值為65%(圖7b)。

圖8為不同濃度的氯化鐵對布朗葡萄藻絮凝效應(yīng)的影響。藻液的沉降高度隨絮凝時(shí)間增加顯著的上升(P<0.05)，在60 min后趨于穩(wěn)定(圖8a)；在絮凝劑的添加量高于0.7 g/L后，絮凝高度有明顯的上升過程；從氯化鐵對其絮凝結(jié)果中可以看出(圖8b)，絮凝劑的濃度對沉降率并無顯著作用(P>0.05)，并且在絮凝60 min后趨于穩(wěn)定。添加量為0.9 g/L時(shí)，藻液的沉降高度和沉降率達(dá)到最大值，分別為10.62 cm、88.0%。

兩種鐵(Ⅲ)對布朗葡萄藻絮凝效應(yīng)的差異，主要是因?yàn)樵趬A性條件下兩種鐵鹽的離子強(qiáng)度：氯化鐵>硫酸鐵，氯化鐵更易與藻體形成絮凝而沉降[15，16]。

圖7 不同濃度硫酸鐵對布朗葡萄藻的絮凝效應(yīng)

圖8 不同濃度氯化鐵對布朗葡萄藻的絮凝效應(yīng)

3 結(jié)論

本研究采用光密度法測定布朗葡萄藻的生物量，確定了布朗葡萄藻的最佳測定波長為680 nm，得出了OD680與藻液細(xì)胞密度的相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線，說明光密度測定生物量的可行性，以此間接測定布朗葡萄藻的絮凝效應(yīng)。

根據(jù)絮凝單因素試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)6種無機(jī)試劑對布朗葡萄藻均有明顯的絮凝效應(yīng)，但硫酸鋁銨、硫酸鋁鉀、硫酸鎂超過一定添加量會(huì)造成藻體死亡；同時(shí)發(fā)現(xiàn)硫酸鋁、硫酸鋁鉀、氯化鐵3種無機(jī)試劑的絮凝效果較其它3種無機(jī)試劑明顯；根據(jù)試驗(yàn)得出：絮凝時(shí)間控制在60 min；硫酸鋁濃度控制在1.1 g/L，沉降高度為12.24 cm，沉降率為91.2%；硫酸鋁鉀濃度控制在0.45 g/L以內(nèi)，沉降高度為10.08 cm，沉降率為93.5%；氯化鐵濃度控制在0.9 g/L，沉降高度為10.62 cm，沉降率為88.0%。

參考文獻(xiàn):

[1]徐 玲, 劉春朝, 李華鐘.布朗葡萄藻的培養(yǎng)基選擇及其產(chǎn)物代謝規(guī)律[J].生物加工過程,2010,8(6):40-45.

[2]許常虹, 俞敏娟.成油藻-布朗葡萄藻的研究[J].水生生物學(xué)報(bào),1988,12(1):90-93.

[3]Brown C, Knights B A. Hydrocarbon content and its relationship to physiological state in the green algaBotryococcusbraunii[J]. Phyotchemsitry, 1969, 8(3):543-547.

[4]Tran H L, Kwon J S, Kim Z H, et al. Statistical optimization of culture media for growth and lipid production ofBotryococcusbrauniiLB572[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2010, 15(2):277-284.

[5]Moheimani N R, Matsuura H, Watanabe M M, et al. Non-destructive hydrocarbon extraction fromBotryococcusbrauniiBOT-22(race B)[J]. Journal of Applied Phycology, 2013:1-11.

[6]吳夏芫,李 環(huán),韋 萍.能源微藻—葡萄藻生物學(xué)特性的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(17):7378-7379.

[7]林 喆,匡亞莉,郭 進(jìn),等.微藻采收技術(shù)的進(jìn)展與展望[J].過程工報(bào),2009,9(6):1242-1248.

[8]Talukdar J, Kalita M C, Goswami B C. Characterization of the biofuel potential of a newly isolated strain of the microalgaBotryococcusbrauniiKtzing from Assam, India[J]. Bioresource Technology, 2013, 149:268-275.

[9]Tran H L, Hong S J, Lee C G. Evaluation of extraction methods for recovery of fatty acids fromBotryococcusbrauniiLB 572 andSynechocystissp. PCC 6803[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2009, 14(2):187-192.

[10]黃振華, 柯愛英, 池 偉,等.7種試劑對3種餌料微藻絮凝效應(yīng)的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(15):7734-7736; 7741.

[11]蔣霞敏, 鄭亦周.14種微藻總脂含量和脂肪酸組成研究[J].水生生物學(xué)報(bào),2003,27(3):243-247.

[12]黃美玲,何 慶,黃建榮,等.小球藻生物量的快速測定技術(shù)研究[J].河北漁業(yè),2010,(4):1-3.

[13]沈萍萍,王朝暉,齊雨藻,等.光密度法測定微藻生物量[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版,2001,22(3): 115-119.

[14]周群英,高延耀.環(huán)境工程微生物學(xué)[M].北京:高等教育出版社,2000:292-293.

[15]王 憲,徐魯榮,陳麗丹,等.海藻生物吸附金屬離子技術(shù)的特點(diǎn)和功能[J].臺灣海峽,2003,22(1):120-124.

[16]王 憲,陳麗丹,徐魯榮,等.海藻生物吸附金屬離子的機(jī)理和影響因素[J].臺灣海峽,2003,22(2):262-268.

[17]Ohmori M, Wolf F R, Bassham J A.Botryococcusbrauniicarbon/nitrogen metabolism as affected by ammonia addition[J]. Archives of Microbiology, 1984, 140(2/3):101-106.

[18]周洪英,王學(xué)松,李 娜,等.關(guān)于海藻吸附水溶液中重金屬離子的研究進(jìn)展[J].科技導(dǎo)報(bào),2006,24(12):61-66.