，，

(武漢市第一醫(yī)院，湖北 武漢 430022 1 婦產(chǎn)科； 2 中心實驗室)

圓柱瘤基因(CYLD)是一種新發(fā)現(xiàn)的抑瘤基因，其缺失可導(dǎo)致頭部或面部的皮膚腫瘤，如家族性圓柱瘤[1]。CYLD基因在人體內(nèi)廣泛分布，作為一種腫瘤抑制基因正受到越來越多學(xué)者的關(guān)注。最新研究結(jié)果顯示，CYLD基因在多種人類腫瘤中表達(dá)下調(diào)，如結(jié)腸癌、肝癌等[2]。HIRAI等[3]在其構(gòu)建的兩株宮頸癌細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)存在CYLD基因的丟失。然而，CYLD基因與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系國內(nèi)尚未見報道。本研究通過檢測CYLD mRNA在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)，初步探討其與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2010年6月—2013年2月，選擇在我院接受手術(shù)治療的病人129例，病人術(shù)前均未接受放、化療，均有完整的臨床和病理資料。其中宮頸鱗癌45例，病人年齡36～64歲，中位年齡46.5歲；根據(jù)FIGO 2009年分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期:Ⅰ期22例，≥Ⅱ期23例；組織學(xué)分級(按WHO標(biāo)準(zhǔn)):Ⅰ-Ⅱ級(高、中分化)29例，Ⅲ級(低分化)16例;局部腫瘤大小:<4 cm者28例，≥4 cm者17例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:有轉(zhuǎn)移16例，無轉(zhuǎn)移29例。宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)64例，包括CINⅠ 26例，CINⅡ-Ⅲ 38例；病人年齡34～66歲，中位年齡46歲。對照組20例，因良性病變行子宮全切，病人年齡37～65歲，中位年齡44歲。3組病人年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 主要試劑

探針、原位雜交檢測試劑盒購自武漢博士德公司;DEPC由美國Sigma公司生產(chǎn);DAB顯色試劑盒購自福州邁新公司。CYLD探針序列為：5′-TGA-ATGGTAAAGAGTGGAATCTGTTCTCGGTGG-TC-3′,5′-ACTGAATGGTAAAGAGTGGAATCT-GTTCTCGGTGG-3′,5′-ATACTTTATCCTCCAC-TCACATCTCAGTCTACAAT-3′。

1.3 CYLD mRNA原位雜交技術(shù)(ISH)檢測

所有手術(shù)病理標(biāo)本均經(jīng)40 g/L甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片備用。切片中滴加地高辛標(biāo)記的CYLD探針，40 ℃恒溫雜交16 h，生物素化鼠抗地高辛抗體37 ℃溫浴60 min，SABC孵育后DAB顯色。用已知陽性切片作為陽性對照，用探針稀釋液替代探針作為陰性對照。操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判斷

CYLD mRNA原位雜交陽性信號為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯黃色或棕黃色顆粒。選擇視野時，每個組織點沿相互垂直的2條直徑方向選擇5個高倍視野，共計數(shù)1 000個細(xì)胞，按陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)及著色深淺進(jìn)行結(jié)果判定[4]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 宮頸組織中CYLD mRNA的表達(dá)

CYLD mRNA陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1)。CYLD mRNA在宮頸鱗癌、CINⅡ-Ⅲ、CINⅠ及正常宮頸組織中的陽性表達(dá)率分別為42.2%(19/45)、52.6%(20/38)、73.1%(19/26)和80.0%(14/20)，宮頸鱗癌、CINⅡ-Ⅲ組織中CYLD mRNA的陽性表達(dá)率明顯低于正常宮頸組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.85、4.42，P<0.05)；CINⅠ組織與正常宮頸組織相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 宮頸鱗癌CYLD mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

宮頸鱗癌CYLD mRNA陽性表達(dá)率與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(χ2=4.64、5.59，P<0.05)，而與組織學(xué)分級、腫瘤大小、病人年齡等均無關(guān)(P>0.05)。見表1。

3 討 論

2003年，TROMPOUKI等[5]報道了一種新的腫瘤抑制基因——CYLD,它是在研究人類頭帕腫瘤綜合征時被發(fā)現(xiàn)的。多位學(xué)者研究顯示，CYLD等位基因突變或缺失可導(dǎo)致多種皮膚腫瘤的發(fā)生,如多發(fā)性家族性毛發(fā)上皮瘤、家族性圓柱瘤等[6-7]。CYLD基因位于人類染色體的16q12-13,其mRNA的長度為5 371 bp,共有20個外顯子[7]。其編碼的CYLD蛋白為含956個氨基酸殘基的蛋白質(zhì),包括細(xì)胞骨架關(guān)聯(lián)蛋白甘氨酸保守結(jié)構(gòu)域(CAP-Gly)和C-末端結(jié)構(gòu)域,后者負(fù)責(zé)編碼泛素羧基末端水解酶 (UCH),能夠從蛋白底物上除去多聚泛素鏈[8]。CYLD參與細(xì)胞內(nèi)多種多信號調(diào)控途徑, 它對信號途徑的調(diào)控依賴于其去泛素化活性。

A：宮頸鱗癌；B：CINⅠ。200倍。

表1 宮頸鱗癌組織中CYLD mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

CYLD蛋白的一個重要的特點是具有和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2 (TRAF2)和IκB激酶復(fù)合物調(diào)節(jié)亞基(NEMO)結(jié)合的特異性位點。 TRAF2作為接頭蛋白和調(diào)控因子在幾乎所有的TNF-R1介導(dǎo)的NF-κB激活過程中起重要作用。NEMO是IκB激酶復(fù)合物3個亞單位中的調(diào)節(jié)亞基,為NF-κB的必需調(diào)控因子。BRUMMEKAMP等[9]的研究結(jié)果表明, CYLD與NEMO相結(jié)合后使TRAF2去泛素化，從而阻斷TRAF2的下游信號通路，抑制NF-κB激活,在抑制腫瘤方面發(fā)揮著重要作用。而一旦CYLD活性喪失,就不能抑制TRAF2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能,從而激活NF-κB途徑,開啟下游信號途徑,導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖并形成腫瘤[10]。

CYLD基因在人體組織中廣泛存在，它不僅是皮膚腫瘤發(fā)生的主要分子機(jī)制,而且在其他腫瘤的形成和發(fā)展中也有重要作用。程永波等[11]研究顯示，肺癌細(xì)胞CYLD基因的表達(dá)較正常肺組織下調(diào)，有效增強(qiáng)肺癌細(xì)胞株A549/H460的CYLD基因表達(dá)后，F(xiàn)asL膜蛋白可通過Fas信號誘導(dǎo)其顯著壞死。HELLERBRAND等[12]應(yīng)用RT-PCR等方法對肝癌細(xì)胞和肝癌組織的研究顯示，在不同的肝癌細(xì)胞株和癌組織中CYLD基因的表達(dá)下調(diào),同時NF-κB的活性增強(qiáng)。

本文的研究結(jié)果顯示，CYLD mRNA在CINⅠ組織中的表達(dá)率與正常宮頸組織比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但在CINⅡ-Ⅲ組織即出現(xiàn)異常低表達(dá)，在宮頸癌組織中CYLD表達(dá)率更低，兩者與正常宮頸組織比較差異均有顯著性。提示隨著疾病的發(fā)展，CYLD基因的陽性表達(dá)率呈下降趨勢，提示CYLD基因表達(dá)異?？赡苁菍m頸病變中的重要事件及早期事件。進(jìn)一步分析宮頸鱗癌組織CYLD mRNA表達(dá)與病人臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，臨床Ⅱ期及以上病人宮頸癌組織中CYLD mRNA的表達(dá)率明顯低于Ⅰ期病人；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人宮頸癌組織中CYLD mRNA的表達(dá)率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，而CYLD mRNA表達(dá)與組織學(xué)分級、腫瘤大小、病人年齡等無明顯相關(guān)性。提示CYLD可能作為宮頸癌進(jìn)展過程中極具價值的生物學(xué)危險因子在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。

綜上所述，CYLD mRNA在宮頸組織中異常低表達(dá)可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但宮頸癌的發(fā)病原因及作用機(jī)制復(fù)雜，CYLD的表達(dá)下降可能不足以引起宮頸細(xì)胞異常轉(zhuǎn)化，還需要多種癌基因和抑癌基因間的相互調(diào)節(jié)、協(xié)同作用。本研究為今后進(jìn)一步探討宮頸癌發(fā)病機(jī)制提供了初步的分子生物學(xué)依據(jù)。

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