毛玉龍 張偉偉 左金華

1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔頜面外科；2.口腔正畸科，濱州 256603

放射治療、舍格倫綜合征以及涎腺炎導(dǎo)致的涎腺萎縮是臨床上常見且亟待解決的難題。研究涎腺對(duì)萎縮和再生的反應(yīng)有可能為涎腺的放射防護(hù)設(shè)計(jì)或?yàn)橄严傥s的治療找到有效的途徑[1]。有學(xué)者[2]認(rèn)為，肌上皮細(xì)胞（myoepithelial cell，MEC）可能是導(dǎo)致唾液腺多種疾病的潛能祖細(xì)胞之一；在繼發(fā)性舍格倫綜合征患者唾液腺炎癥病變過(guò)程中，MEC亦可作為靶細(xì)胞被淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)破壞，并最終導(dǎo)致腺泡和導(dǎo)管上皮喪失[3]。目前關(guān)于MEC在腮腺萎縮后再生過(guò)程中變化方面的研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)結(jié)扎大鼠腮腺主導(dǎo)管14 d后使其再通，建立腮腺萎縮后再生的動(dòng)物模型，觀察MEC在該過(guò)程中的數(shù)量及分布的變化情況。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

選用無(wú)特定病原體動(dòng)物（specif ied pathogen free，SPF）級(jí)成年雄性Wistar大鼠54只為研究對(duì)象，質(zhì)量（260±15）g，購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（批號(hào)：魯動(dòng)質(zhì)字D20021024）。將大鼠隨機(jī)分為8個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)正常對(duì)照組，每組6只，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將實(shí)驗(yàn)組的大鼠使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%水合氯醛（10 mL·kg-1）行腹腔內(nèi)注射麻醉，于右耳前下方切開皮膚，顯露右側(cè)腮腺主導(dǎo)管，用3—0絲線將直徑0.8 mm醫(yī)用鋼絲與主導(dǎo)管捆綁雙重結(jié)扎。主導(dǎo)管結(jié)扎后第14天，再次麻醉大鼠，取出醫(yī)用鋼絲使主導(dǎo)管再通，分別于再通后第0、1、3、5、7、10、14、21天各處死1組大鼠，切取右側(cè)腮腺，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛固定液中固定。正常對(duì)照組僅手術(shù)顯露主導(dǎo)管但不結(jié)扎。

1.3 觀察方法

1.3.1 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察 將各組腮腺組織樣本固定24 h后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，然后浸蠟、包埋，制成4 μm厚切片，進(jìn)行HE染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察腮腺的組織學(xué)變化。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色觀察 采用特異性肌動(dòng)蛋白α-SMA單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），應(yīng)用SABC法對(duì)腮腺標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，抗體稀釋度為1∶200，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，觀察MEC的陽(yáng)性表達(dá)情況。

1.3.3 MEC計(jì)數(shù) 將免疫組織化學(xué)切片置于OLYMPUS BX51型顯微鏡下（Olympus公司，日本）觀察，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)數(shù)MEC的數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HE觀察結(jié)果

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的HE觀察結(jié)果見圖1。正常對(duì)照組：腮腺腺小葉中有密集的腺泡細(xì)胞及散在的導(dǎo)管系統(tǒng)（閏管、紋管及排泄管），腺泡細(xì)胞大小均勻，排列緊湊（圖1A）。實(shí)驗(yàn)組：導(dǎo)管結(jié)扎14 d組（即再通0 d組），腮腺實(shí)質(zhì)內(nèi)絕大多數(shù)腺泡萎縮消失，僅在腺小葉邊緣可見少數(shù)散在且體積明顯減小的腺泡細(xì)胞，導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)明顯增多，占據(jù)腺小葉的大部，并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1B）；再通1 d組與再通0 d組相比，腺小葉結(jié)構(gòu)未見明顯變化；再通3 d組可見體積較小的新生腺泡出現(xiàn)在腺小葉邊緣（圖1C）；再通5 d組可見除腺小葉邊緣外，腺小葉中央新生腺泡數(shù)量也明顯增多，導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)明顯減少；再通7 d組，成熟的腺泡細(xì)胞已占據(jù)大部分腺小葉，腺泡形態(tài)基本恢復(fù)正常，但腺泡排列仍較正常對(duì)照組稀疏（圖1D）；再通10 d組，成熟腺泡進(jìn)一步增多，導(dǎo)管系統(tǒng)進(jìn)一步減少；再通14 d組及再通21 d組，腺小葉的結(jié)構(gòu)與正常對(duì)照組相近，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯差異。

圖1 正常對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組腮腺的組織學(xué)變化 HE× 400Fig 1 Histological changes of parotid glands for control and experimental group HE× 400

2.2 免疫組織化學(xué)觀察結(jié)果

正常對(duì)照組：呈陽(yáng)性表達(dá)的MEC主要分布在閏管及腺泡周圍，形態(tài)呈星形或梭形，紋管周圍亦可見少量MEC（圖2A）；再通0 d組與正常對(duì)照組比較，MEC數(shù)目明顯增多，主要分布在大量導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)周圍，此時(shí)導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)呈典型的雙套層結(jié)構(gòu)，大量MEC位于外層，形態(tài)呈梭形或星形（圖2B）；再通1 d組與再通0 d組對(duì)比，MEC數(shù)目及分布未見明顯改變；再通3 d組，隨著新生腺泡的出現(xiàn)，MEC數(shù)目明顯減少，大多分布在導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)及新生腺泡周圍（圖2C）；再通5 d組，新生腺泡逐漸增多，導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)明顯減少，MEC數(shù)目進(jìn)一步明顯減少；再通7 d組，新生腺泡已占據(jù)大部分腺小葉，導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)明顯減少，MEC數(shù)目減少變緩，主要分布在體積較小的新生腺泡及導(dǎo)管系統(tǒng)表面（圖2D）；再通10 d組，MEC數(shù)量進(jìn)一步減少；再通14 d組及21 d組，腺小葉結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，MEC數(shù)目及分布也基本恢復(fù)正常，與正常對(duì)照組未見明顯差別。

圖2 正常對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組腮腺M(fèi)EC的陽(yáng)性表達(dá) SABC× 400Fig 2 MEC positive expression in parotid glands for control and experimental group SABC× 400

2.3 MEC計(jì)數(shù)結(jié)果

各組動(dòng)物的MEC計(jì)數(shù)結(jié)果見表1：與正常對(duì)照組相比，再通0、1、3、5、7、10 d組的MEC數(shù)量均有明顯差異（P<0.05），再通14 d及21 d組無(wú)明顯差異（P>0.05）；再通3、5 d時(shí)MEC數(shù)量下降最為明顯，再通7 d開始，MEC數(shù)量下降明顯放緩。

表1 腮腺再生過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的MEC計(jì)數(shù)Tab 1 Numbers of MEC during each step of duct reopening ±s

表1 腮腺再生過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的MEC計(jì)數(shù)Tab 1 Numbers of MEC during each step of duct reopening ±s

注：*與正常對(duì)照組相比，P<0.05。

組別MEC數(shù)量正常對(duì)照550.40±80.465再通0 d1 584.30±180.426*再通1 d1 504.62±205.847*再通3 d1 242.55±272.810*再通5 d891.25±312.467*再通7 d765.50±245.214*再通10 d688.64±166.376*再通14 d611.26±154.379再通21 d584.50±138.589

3 討論

本實(shí)驗(yàn)按照潘光華等[4]的實(shí)驗(yàn)方法，將醫(yī)用鋼絲捆綁結(jié)扎于大鼠腮腺主導(dǎo)管，14 d后取出鋼絲使導(dǎo)管再通，成功制造了腮腺萎縮后再生的動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)觀察到，主導(dǎo)管結(jié)扎后14 d，腺泡細(xì)胞幾乎全部消失，取而代之的是腺體內(nèi)出現(xiàn)了大量的導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)，腺實(shí)質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，僅在腺小葉邊緣殘留少量的腺泡細(xì)胞。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法，觀察到MEC的數(shù)量明顯增多，幾乎全部分布于導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)的周圍，呈雙套層樣結(jié)構(gòu)，形態(tài)呈梭形或星形。這與趙騰達(dá)等[5]的觀察結(jié)果是一致的。

主導(dǎo)管結(jié)扎后腺體萎縮的機(jī)理目前仍然不明確。大部分學(xué)者[6-7]認(rèn)為，這是由于細(xì)胞自身的凋亡造成的；但Fujita-Yoshigaki等[8]發(fā)現(xiàn)，涎腺萎縮過(guò)程中，腺泡細(xì)胞可通過(guò)Src-p38MAPs信號(hào)傳導(dǎo)通路快速轉(zhuǎn)變?yōu)閷?dǎo)管樣細(xì)胞。還有學(xué)者[9]通過(guò)分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在涎腺萎縮過(guò)程中，導(dǎo)管細(xì)胞因過(guò)表達(dá)抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤/白血病（B-cell lymphoma/leukemia，Bcl）基因未發(fā)生凋亡，而腺泡細(xì)胞由于表達(dá)Bcl相關(guān)X蛋白Bax而促進(jìn)其自身的凋亡。

Burgess等[10]指出，在腺體萎縮過(guò)程中，MEC能在一定程度上抑制腺體的萎縮。MEC內(nèi)含有肌動(dòng)蛋白，能夠發(fā)生收縮，促進(jìn)腺泡及導(dǎo)管的分泌[11]。大量研究發(fā)現(xiàn)，MEC在正常狀況下增殖率很低，當(dāng)腺體受到損傷時(shí)則出現(xiàn)快速增殖。Walker等[12]發(fā)現(xiàn)，在正常唾液腺內(nèi)很少觀察到MEC，但隨著腺體進(jìn)行性萎縮，MEC陽(yáng)性表達(dá)明顯，并最終完全圍繞在導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)周圍。本研究中，主導(dǎo)管結(jié)扎14 d后，腺泡細(xì)胞大量消失，而MEC數(shù)量不減反增，說(shuō)明MEC在抑制腺體萎縮方面發(fā)揮了重要作用。筆者推測(cè)出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因在于，當(dāng)導(dǎo)管發(fā)生阻塞時(shí)，導(dǎo)管內(nèi)的壓力增加，腺泡細(xì)胞不再需要MEC促進(jìn)分泌，為了抵抗導(dǎo)管阻塞帶來(lái)的壓力，MEC大量增殖，并圍繞在導(dǎo)管周圍；同時(shí)由于腺體萎縮，單位視野中MEC數(shù)量相對(duì)增多。關(guān)于大量增生的MEC的來(lái)源，目前存在兩種觀點(diǎn)：一是導(dǎo)管細(xì)胞作為潛能細(xì)胞大量分化為MEC，二是原來(lái)位于腺泡周圍的MEC發(fā)生了移行。至于具體原因還需要進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，主導(dǎo)管再通第1天至第5天時(shí)，導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)明顯減少，體積較小的新生腺泡細(xì)胞自腺小葉邊緣開始大量增殖；究其來(lái)源，大部分學(xué)者[13]認(rèn)為是由閏管儲(chǔ)備細(xì)胞分化而來(lái)，筆者認(rèn)為，腺小葉周圍殘余的腺泡細(xì)胞主動(dòng)增殖分化也是其大量增殖的原因之一。此階段MEC數(shù)量減少最為明顯，且主要分布在新生腺泡周圍，故筆者推測(cè)，腮腺的再生主要發(fā)生在主導(dǎo)管再通后的5 d內(nèi)。再通第7天，隨著腺體的再生恢復(fù)，MEC數(shù)量減少的程度不如前期明顯，形態(tài)也逐漸恢復(fù)正常，主要分布在體積較小的新生腺泡及殘存的導(dǎo)管樣組織周圍。再通14 d時(shí)，鏡下觀察到的腺實(shí)質(zhì)內(nèi)各解剖結(jié)構(gòu)及MEC已基本恢復(fù)正常。

綜上所述，本研究通過(guò)建立腮腺萎縮后再通的動(dòng)物模型，成功觀察到腮腺萎縮后再生過(guò)程中MEC及腺小葉中各結(jié)構(gòu)的組織學(xué)變化，為研究腮腺導(dǎo)管阻塞后再通的變化提供理論依據(jù)，并為進(jìn)一步研究腮腺萎縮的治療打下基礎(chǔ)。

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